小鼠腎近曲小管上皮細(xì)胞頂側(cè)膜鉀通道的電生理學(xué)特性及環(huán)孢素A的影響.pdf

1、腎臟近曲小管鉀離子通道在維持細(xì)胞膜電位、調(diào)節(jié)細(xì)胞體積以及維持水與電解質(zhì)的重吸收和分泌等方面，均起著非常關(guān)鍵的作用，而且近曲小管是缺氧和中毒損傷最易發(fā)生的部位，因此，對(duì)腎臟近曲小管鉀離子通道的研究具有較重要的生理學(xué)意義，目前尚未完全了解其生理學(xué)特性和功能。 環(huán)孢素A是臨床器官移植中廣泛使用的免疫抑制劑，但其嚴(yán)重的腎毒性限制了它的使用。其發(fā)病機(jī)制尚未完全明了，目前研究發(fā)現(xiàn)它不僅可引起血液動(dòng)力學(xué)的改變，而且對(duì)腎小管有直接的損害作用，且

2、與近曲小管密切相關(guān)。但對(duì)于近曲小管離子通道的改變研究涉及甚少。為此，本實(shí)驗(yàn)建立正常小鼠腎臟近曲小管上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)體系，采用細(xì)胞貼附式、內(nèi)面向外式膜片鉗技術(shù)研究正常小鼠腎臟近曲小管上皮細(xì)胞頂側(cè)膜K+通道的電生理學(xué)特性，觀察免疫抑制劑環(huán)孢素A對(duì)K+通道特性的影響，探討其可能的作用機(jī)制。 方法： 采取改良的膠原酶消化-密度梯度離心法進(jìn)行小鼠腎臟近曲小管上皮細(xì)胞的分離及純化，獲得的近曲小管上皮細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行單層培養(yǎng)

3、。通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)排斥法鑒定細(xì)胞活性；光鏡、堿性磷酸酶染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變；透射電鏡觀察其超微結(jié)構(gòu)。 在原代培養(yǎng)的細(xì)胞和經(jīng)環(huán)孢素A預(yù)處理(終濃度300ng/m1)的培養(yǎng)細(xì)胞上采用細(xì)胞貼附式、內(nèi)面向外式膜片鉗技術(shù)記錄近曲小管頂側(cè)膜K+通道電流進(jìn)行分析比較。 主要結(jié)果： 1.采用改良的膠原酶消化-密度梯度離心法獲得的細(xì)胞大小一致，活性＞95％；光鏡下可見(jiàn)未貼壁細(xì)胞為圓形，胞體光滑，折光性好，直徑約8.5～10.5μm；貼

4、壁細(xì)胞呈梭形，透明度增大而折光性減弱，融合的單層細(xì)胞呈鵝卵石樣鋪滿瓶底；堿性磷酸酶染色呈陽(yáng)性；電鏡檢查見(jiàn)面向液層的刷狀緣有微絨毛形成，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)豐富的線粒體、溶酶體。 2.小鼠腎近曲小管上皮細(xì)胞頂側(cè)膜上的這種K+通道在多數(shù)膜片(61％)中自發(fā)性開(kāi)放，無(wú)自發(fā)性開(kāi)放的通道在牽張時(shí)可被激活。使用含有TTX、Cd2+的浴液S2灌流時(shí)仍能記錄到這種通道。該通道表現(xiàn)為單一的電流幅度，在超極化狀態(tài)下表現(xiàn)為內(nèi)向電流，其斜率電導(dǎo)為25.5±0.4

5、pS(鉗制電壓在20mV～60mV，n=8)，通道開(kāi)放活動(dòng)隨極化程度的增大而增加。在去極化狀態(tài)下表現(xiàn)為外向電流，并具有內(nèi)向整流特性，其外向電流的弦電導(dǎo)為9.25±0.6pS(鉗制電壓在-40mV到-60mV,n=6)；在對(duì)稱性鉀浴液中該通道的翻轉(zhuǎn)電位是4.2±1.3mV，內(nèi)面向外式兩側(cè)不對(duì)稱溶液(70mMbath/140mMpipette)時(shí)翻轉(zhuǎn)電位在-15.1±3.5mV，Pk/PNa≈8∶1；該通道具有一個(gè)開(kāi)放時(shí)間常數(shù)和兩個(gè)關(guān)閉時(shí)間

6、常數(shù)；開(kāi)放概率與鉗制電壓依賴性不明顯；通道的活動(dòng)受細(xì)胞外液pH值的影響，隨著細(xì)胞外液酸性增加(pH7.4～6.8)開(kāi)放概率減小。 3.經(jīng)CsA處理后記錄到的K+通道電流幅度較之相同鉗制電壓下的正常通道差異不明顯，其通道的Ⅰ-Ⅴ關(guān)系并沒(méi)有因CsA處理的作用而發(fā)生位移或改變，但開(kāi)放概率明顯降低，且差異顯著。 結(jié)論： 1.采用改良的膠原酶消化-密度梯度離心法分離的細(xì)胞建立的原代培養(yǎng)方法純化度高，性質(zhì)可靠。 2.