PPARδ受體激動劑在孢和脂肪酸和TNF-α誘導的小鼠近曲小管上皮細胞炎癥反應中的作用.pdf

1、前言
　　 隨著現(xiàn)代飲食習慣和生活方式的改變,在世界范圍內糖尿病的發(fā)病率逐年增加。在西方國家,糖尿病腎病是引起終末期腎病(ESRD)最常見的病因,在發(fā)展中國家,其發(fā)病率也逐年增加。蛋白尿和腎小球硬化是糖尿病腎病最主要的特征。近年來應用ARB類藥物的強化治療通過減少蛋白尿的排出,能改善糖尿病腎病患者的預后,但是在一些情況下,ARB也不能起作用。近年來人們越來越意識到脂毒性在糖尿病腎病進展過程中的作用,游離脂肪酸結合的白蛋白被腎小球

2、濾過膜濾過,從近曲小管重吸收,能引起嚴重的小管間質損傷。腎小管間質損傷與慢性腎臟病預后的關系更加密切,因此有必要研發(fā)新的治療策略,防止和延緩小管間質損傷的進展,改善糖尿病腎病的預后。
　　 過氧化物增殖體激活受體(Peroxisome proliferator activated receptors(PPARs))屬于配體激活的轉錄因子核受體超家族的一員。目前發(fā)現(xiàn)該家族有3種異構體:PPARα,δ和γ。作為轉錄因子的PPARs通

3、過調節(jié)特定的目的基因的表達,影響脂代謝,糖代謝穩(wěn)態(tài),細胞分化,免疫反應,炎癥和腫瘤等重要的代謝過程。PPARs能被大量的內源性和越來越多的外源合成的配體所激活。PPARα受體激動劑(貝特類)和PPARγ受體激動劑(噻唑烷二酮類)作為降脂藥物和胰島素增敏劑已經在臨床上廣泛應用,而且被證明具有腎臟保護作用;而PPARδ受體激動劑出現(xiàn)的較晚,還處于臨床試驗階段,其是否具有腎臟保護作用還沒有定論。目前一些研究表明PPARδ受體參與炎癥的過程,在

4、心臟,脂肪組織,內皮細胞,巨噬細胞等組織和細胞中PPARδ受體激動劑有抗炎作用,但是PPARδ受體在腎臟組織和細胞的作用還鮮有報道。
　　 目的:
　　 基于這些發(fā)現(xiàn),我們假設PPARδ受體激動劑在近曲小管上皮細胞能發(fā)揮抗炎作用,是一種潛在的治療糖尿病腎病的新選擇。為了證明這一假設,我們利用GW501516這一高選擇性的PPARδ受體激動劑進行以下實驗:利用游離脂肪酸結合的白蛋白誘導的蛋白負荷性腎病小鼠模型這一小管間質損

5、傷的模型,給予PPARδ受體激動劑GW501516,觀察PPARδ受體激動劑是否能發(fā)揮抗炎作用,減輕小管間質的損害;利用培養(yǎng)的小鼠近曲小管上皮細胞,觀察GW501516是否能減輕飽和脂肪酸,TNF-α和白蛋白誘導的炎癥反應并探討其分子機制。
　　 方法:
　　 建立脂肪酸結合白蛋白誘導的蛋白負荷性腎病小鼠模型。預先用含有PPARδ受體激動劑501516的治療食物和對照食物喂養(yǎng)小鼠,實驗結束時腎臟行HE染色,F4/80免疫

6、組化染色,觀察治療組和對照組腎小管間質損傷以及腎間質中巨噬細胞浸潤的變化。并用實時定量PCR方法檢測腎組織中巨噬細胞趨化蛋白-1(MCP-1),腫瘤壞死因子-α(TNF-α),F4/80 mRNA水平的變化,
　　 培養(yǎng)小鼠近曲小管上皮細胞系,研究PPARδ受體激動劑GW501516是否能抑制白蛋白,飽和脂肪酸和TNF-α誘導的MCP-1mRNA水平的變化。利用干擾RNA(siRNA)介導的PPARδ基因敲除研究GW501516

7、的抗炎作用是否通過PPARδ受體實現(xiàn),并研究核因子-Kappa b(NF-Kb)的信號轉導途徑在GW501516抗炎過程中的作用。
　　 結果:
　　 (1)與對照組相比,脂肪酸結合的牛血清白蛋白腹腔注射4天組小鼠體重減輕(20.52±1.53g vs26.26±2.62 g,p＜0.05)腎重/體重的比率增加(0.84±0.1％vs0.64±0.03 p＜0.05)。與GW501516對照組相比,蛋白負荷+GW5015

8、16治療組體重也減輕(20.2±1.53 g vs24.25±1.11g p＜0.05),腎重/體重的比率增加(0.86±0.14％VS0.56±0.02％,p＜0.05)。但蛋白負荷組與蛋白負荷+GW501516治療組之間無明顯差異(20.52±1.53 VS20.2±1.53,p＞0.05)。而各組血清胱抑素水平在實驗前和實驗后無明顯變化(678.64±27.95 ng/ml VS579.68±51.55 ng/ml VS618±8

9、4.27 ng/mlVS573.12±60.75 ng/ml),各組間的差異不顯著(p＞0.05)。
　　 (2)HE染色顯示:腹腔注射游離脂肪酸結合的白蛋白能引起嚴重的近曲小管損傷,病理改變特征為彌漫性的近曲小管上皮細胞空泡變性,腎小管細胞萎縮和管腔擴張,管型形成。預先喂食含有GW501516食物的小鼠其小管損傷明顯減輕。而對照組和單純GWS01516治療組的近曲小管上皮細胞無明顯的變化。模型組的腎小管損傷評分明顯增加,而GW

10、501516治療組的腎小管損傷評分明顯改善(2.925±0.993 vs1.467±0.776),有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。F4/80免疫組化染色顯示模型組在腎小管周圍腎間質區(qū)F4/80陽性的巨噬細胞明顯增加,而GW501516治療能明顯地減輕巨噬細胞的浸潤。
　　 (3)與對照組相比,蛋白負荷組腎臟MCP-1,TNF-α和F4/80mRNA的表達水平明顯增加,GW501516治療使三者的表達明顯降低,且與模型組比較有顯著差

11、異(p＜0.05)。
　　 (4)150uM的棕櫚酸,10nMTNF-α和30％白蛋白刺激12小時能誘導小鼠近曲小管上皮細胞MCP-1在mRNA水平上的表達增加,而GW501516以劑量依賴(1um,2.5um,5um)的方式抑制棕櫚酸和TNF-α和誘導的MCP-1表達的增加。在5 um濃度下,這種抑制作用有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。但是GW501516在任何濃度下均不能抑制白蛋白誘導的MCP-1水平的增加。
　　 (

12、5)PPARδsiRNA能在蛋白水平和基因水平阻斷PPARδ受體的表達,而且在阻斷細胞中GW501516誘導PPARδ受體靶基因丙酮酸脫氫酶激酶4(PDK4),脂肪細胞分化相關蛋白(ADRP)的表達相應被阻斷。但是在阻斷細胞中GW501516仍然能夠發(fā)揮抗炎作用,抑制棕櫚酸和TNF-α誘導的MCP-1在mRNA水平的表達。
　　 (6)培養(yǎng)的近曲小管上皮細胞在棕櫚酸刺激后1小時,抑制激酶B(IkB)的磷酸化增加,p65的核轉移也

13、增加。其上游的調節(jié)因子絲裂原活化蛋白激酶MAPKs(JNK,P38,ERK1/2)及轉化生長因子β-激活激酶1(TAK1)的磷酸化在棕櫚酸刺激1小時后也增加。而GW501516預處理能抑制TAK1,IkB的磷酸化和p65的核轉移。而對MAPKs(JNK,P38,ERK1/2)的磷酸化不發(fā)生影響。
　　 (7)在TNF-α刺激的近曲小管上皮細胞,我們也得到類似的結果。培養(yǎng)的近曲小管上皮細胞在TNF-α刺激后5分鐘后,IkB的磷酸化

14、增加,10分鐘后p65的核轉移也增加。其上游的調節(jié)因子TAK1的磷酸化在TNF-α刺激5分鐘后也增加。而GW501516預處理抑制IkB的磷酸化和p65的核轉移,以及TAK1的磷酸化。
　　 結論:
　　 (1)在游離脂肪酸結合的白蛋白負荷性腎病小鼠模型中,脂蛋白重吸收導致近曲小管損傷和巨噬細胞在間質的浸潤,并引起炎癥性細胞因子MCP-1,TNF-αmRNA水平的升高。PPARδ受體激動劑GW501516能減輕游離脂肪酸

15、結合的白蛋白負荷性腎病大鼠腎小管間質的損傷和炎癥反應,具有腎臟腎臟保護作用。
　　 (2)在培養(yǎng)的小鼠近曲小管上皮細胞中,PPARδ受體激動劑GW501516能抑制棕櫚酸和TNF-α誘導MCP-1mRNA水平的增加,但是GW501516不能抑制白蛋白誘導的小鼠近曲小管上皮細胞MCP-1mRNA水平的增加。GW501516在近曲小管上皮細胞能發(fā)揮抗炎作用。
　　 (3)PPARδ受體激動劑GW501516的抗炎活性可能與P