實(shí)驗(yàn)性自身免疫灰質(zhì)病模型IgG的相關(guān)研究.pdf

1、目的：肌萎縮側(cè)索硬化(Amyotrophiclateralsclerosis，ALS)是一種進(jìn)展性以選擇性上、下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性為特征的神經(jīng)變性疾病。ALS病人多在起病后3-5年內(nèi)死亡。目前對(duì)ALS沒(méi)有特殊治療方法。關(guān)于該病的病因和發(fā)病機(jī)制還不明確，曾提出多種假說(shuō)，包括興奮毒作用、自身免疫異常、氧化應(yīng)激、神經(jīng)元調(diào)亡及線粒體功能障礙等。越來(lái)越多的證據(jù)表明自身免疫尤其是免疫球蛋白G(IgG)在ALS發(fā)病中起重要作用。實(shí)驗(yàn)性自身免疫灰質(zhì)病(ex

2、perimentalautoimmunegraymatterdisease，EAGMD)模型是Engelhardt等在1990年建立的，其臨床癥狀和病理改變與ALS相似，因?yàn)榇四Ｐ褪怯擅庖呓閷?dǎo)的，所以通過(guò)它研究免疫機(jī)制在ALS發(fā)病中的作用有重要的參考價(jià)值。我們建立實(shí)驗(yàn)性自身免疫性灰質(zhì)病模型，通過(guò)對(duì)動(dòng)物病情變化的觀察、電生理檢查、組織化學(xué)和免疫組化染色，探討IgG損傷運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的可能機(jī)制，為自身免疫因素在ALS發(fā)病中的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

3、 方法：1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：4月齡雄性白化病遠(yuǎn)交系Hartley豚鼠2實(shí)驗(yàn)分組2.1EAGMD組：將牛脊髓前角加入到PBS和福氏佐劑中做成勻漿免疫20只豚鼠，以豚鼠出現(xiàn)肢體無(wú)力定為模型動(dòng)物，無(wú)力起始時(shí)間定為發(fā)病時(shí)間，以動(dòng)物不能翻身定為取材時(shí)間，發(fā)病到取材的時(shí)間為病程。 2.2免疫對(duì)照組：將PBS和福氏佐劑做成勻漿免疫豚鼠，以與EAGMD動(dòng)物同日取材的動(dòng)物計(jì)為免疫對(duì)照組動(dòng)物。 2.3正常對(duì)照組：用PBS皮下注射豚鼠，以與EA

4、GMD動(dòng)物同日取材的動(dòng)物計(jì)為正常對(duì)照組動(dòng)物。 3肌電圖檢查每四周給動(dòng)物做一次后肢肌電圖。 4組織化學(xué)與免疫組化染色4.1取豚鼠新鮮股直肌行HE染色，動(dòng)物麻醉后用4％多聚甲醛-0.05％戊二醛-0.2％苦味酸灌注，取腰膨大和后肢骨間肌。 4.2固定后的腰膨大做甲苯胺藍(lán)染色，以計(jì)算運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)目，F(xiàn)ITC-羊抗豚鼠IgG染色以了解IgG的沉積情況；骨間肌做神經(jīng)肌肉接頭處IgG沉積的熒光雙標(biāo)染色：神經(jīng)肌肉接頭用羅丹明-

5、α-金環(huán)蛇毒素標(biāo)記，顯紅色熒光，IgG用FITC-羊抗豚鼠IgG染色，顯綠色熒光，同一個(gè)位置雙重染色表明神經(jīng)肌肉接頭處IgG沉積陽(yáng)性，同一標(biāo)本中IgG沉積陽(yáng)性神經(jīng)肌肉接頭數(shù)與所檢的總的神經(jīng)肌肉接頭數(shù)的比例，計(jì)為神經(jīng)肌肉接頭處IgG沉積率。 5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析t檢驗(yàn)分析正常對(duì)照組、免疫對(duì)照組與EAGMD組腰膨大運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異，卡方檢驗(yàn)分析3組在神經(jīng)肌肉接頭IgG沉積率的差別，相關(guān)分析明確IgG在神經(jīng)肌肉接頭沉積比率與EAG

6、MD動(dòng)物病程的關(guān)系。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。 結(jié)果：1在20只用牛脊髓前角勻漿免疫的豚鼠中有9只出現(xiàn)肢體進(jìn)行性無(wú)力，被認(rèn)定為EAGMD動(dòng)物，EAGMD組9只豚鼠的病程分別為3，4，4，7，14，24，29，42，64天，平均21天；免疫對(duì)照組和正常對(duì)照組由與EAGMD同日取材的動(dòng)物各9只組成；肌電圖檢查：EAGMD動(dòng)物均出現(xiàn)正尖電位，對(duì)照組未見(jiàn)異常；EAGMD動(dòng)物肌肉HE染色，出現(xiàn)成束萎縮，提示失神經(jīng)改變，對(duì)照組未見(jiàn)異常。

7、 2腰膨大甲苯胺藍(lán)顯示EAGMD組運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)目明顯少于對(duì)照組，P＜0.05；EAGMD組IgG在神經(jīng)肌肉接頭處沉積的比率(27.6％)明顯高于免疫對(duì)照組(5.6％)和正常對(duì)照組(4.1％)，P＜0.01；神經(jīng)肌肉接頭處IgG沉積率與動(dòng)物病程呈負(fù)向直線關(guān)系，r=0.64，P＜0.05。 3在9只EAGMD動(dòng)物中有4只的脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中有IgG的沉積，其病程都在1周內(nèi)，免疫對(duì)照組與正常對(duì)照組未發(fā)現(xiàn)脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中有IgG的沉積。

8、 結(jié)論：1建立了EAGMD動(dòng)物模型，其后肢肌電圖出現(xiàn)正尖波，肌肉病理顯示神經(jīng)源性受損，脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元丟失明顯，這些改變與ALS相似，EAGMD模型可作為研究免疫因素在ALS作用的一個(gè)有價(jià)值動(dòng)物模型。 2EAGMD動(dòng)物神經(jīng)肌肉接頭處IgG沉積率明顯高于免疫對(duì)照組和正常對(duì)照組，并且IgG沉積率與動(dòng)物的病程呈負(fù)向直線關(guān)系，支持IgG以神經(jīng)肌肉接頭作為一個(gè)攻擊點(diǎn)而影響動(dòng)物疾病的發(fā)展。 3病程短的EAGMD動(dòng)物脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元