防風提取物聯(lián)合三氧化二砷對急、慢性髓系白血病體內外實驗研究.pdf

1、目的:以人急性髓系白血病細胞株HL-60和人慢性髓系白血病細胞株K562為實驗對象，探討ATO及防風提取物對該細胞株生長的影響。檢測防風提取物單獨與聯(lián)合ATO后對HL-60、K562細胞增殖、凋亡的影響，并探討其分子機制。建立NOD/SCID-AML小鼠模型，通過體內實驗驗證防風提取物對ATO的減毒增效作用。
　　方法:
　　1.防風提取物抑制HL-60、K562細胞增殖的作用研究
　　不同劑量防風提取物(1500、1

2、250、1000、750、500、250μg/ml)作用于HL-60和K562細胞株48h。MTT法檢測防風提取物對HL-60、K562細胞增殖的影響并計算出防風提取物對HL-60、K562細胞的半數(shù)抑制濃度;倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)學變化。
　　2.防風提取物聯(lián)合ATO對HL-60、K562增殖、凋亡的影響
　　采用HL-60和K562兩種細胞株，分為空白對照組、防風提取物組、ATO組、防風提取物聯(lián)合ATO組。MTT法檢測H

3、L-60、K562細胞增殖變化;流式細胞儀檢測HL-60、K562細胞凋亡率和細胞周期分布。
　　3.建立NOD/SCID-AML小鼠模型
　　NOD/SCID小鼠，雄性，3～4周齡，適應性飼養(yǎng)1周，隨機分為A、B、C、D、E、F、G7組。A、B、C組小鼠接種腫瘤細胞前給予300 cGy60Co照射（照射劑量率為116 cGy/min），照射后24h內尾靜脈注射對數(shù)生長期HL-60細胞(A組:1×107/只;B組:5×106

4、/只;C組:3×106/只)。D、E、F組小鼠無預處理，直接尾靜脈注射對數(shù)生長期HL-60細胞（D組:1×107/只;E組:5×106/只;F組:3×106/只）。G組小鼠不做處理為正常對照組。日常觀察小鼠的發(fā)病和身體淺表部位腫瘤生長情況;通過流式細胞儀分析外周血、肝脾組織和骨髓中HL-60細胞比例;取瀕死小鼠的心、肝、脾、肺、腎、腦、骨髓及腫瘤組織，進行組織病理學和細胞學檢查，綜合判斷模型是否建立成功。
　　4.基于NOD/SC

5、ID-AML小鼠模型，觀察防風提取物減毒增效功能的實驗研究
　　建模:4～5周齡NOD/SCID小鼠尾靜脈注射1×107的HL-60細胞，定期檢查小鼠外周血細胞形態(tài)，流式細胞儀檢測小鼠外周血中CD33陽性率，確定模型建立成功。分組:建模后的小鼠隨機分為4組:模型組（不給予藥物治療）、單用防風提取物組（500 mg/kg灌胃×15d）、單用ATO組(3 mg/kg ATO腹腔注射×15d)、防風提取物聯(lián)合ATO組（500 mg/kg

6、防風提取物灌胃+3 mg/kg ATO腹腔注射×15d），觀察各組小鼠生存時間。實驗后期，每組隨機麻醉處死3只小鼠，采集主要臟器標本，觀察臟器損傷情況。
　　結果:
　　1.防風提取物能夠抑制K562、HL-60細胞增殖
　　750、1000、1250、1500μg/ml防風提取物對K562細胞有明顯的增殖抑制作用，48h的OD值與對照組比較有顯著性差異（P＜0.05）;防風提取物6個濃度組對HL-60細胞有明顯增殖抑

7、制作用，48h的OD值與對照組比較有顯著性差異（P＜0.05），其抑制增殖的作用呈劑量依賴性。
　　2.防風提取物能夠增強ATO對K562、HL-60細胞增殖的抑制作用
　　防風提取物與ATO具有協(xié)同抑制HL-60、K562細胞生長的作用，這種協(xié)同抑制作用隨著防風提取物濃度的增加而增強;500、250μg/ml防風提取物分別與1μg/ml、2μg/ml ATO聯(lián)用對K562細胞的凋亡率與空白對照組或ATO組相比顯著升高(P＜

8、0.05);500、250μg/ml防風提取物分別與1、0.5μg/ml ATO聯(lián)用對HL-60細胞的凋亡率與空白對照組或ATO組相比顯著升高（P＜0.05）;2、1、0.5μg/ml ATO作用48h后，與空白對照組相比，K562細胞G2-M期比例升高、G0-G1期細胞比例降低;HL-60細胞G0-G1期、G2-M期細胞比例升高、S期細胞比例降低。兩藥聯(lián)用后K562細胞S期細胞比例與空白對照組或單用ATO組升高;HL-60細胞周期的變

9、化不規(guī)律，凋亡細胞比例與空白對照組或ATO組相比顯著升高(P＜0.05)并呈現(xiàn)出劑量依賴性。
　　3.NOD/SCID-AML小鼠模型建立成功
　　造模10d左右，小鼠外周血涂片中可檢測到HL-60細胞;28d左右，部分小鼠出現(xiàn)后肢癱瘓的癥狀;35d左右，部分小鼠身體淺表部位出現(xiàn)實體瘤，各處理組小鼠全部發(fā)病，發(fā)病后期外周血、骨髓可檢測到大量白血病細胞并浸潤到肝、脾等臟器。40d左右，小鼠陸續(xù)死亡，60Co照射過的所有小鼠在5

10、2d內死亡，平均生存時間為(39.33±12.66)d;沒有接受60Co照射的所有小鼠在64d內全部死亡，平均生存時間為(55.67±10.41)d，發(fā)病率為100％，證實NOD/SCID-AML小鼠模型建立成功。
　　4.防風提取物聯(lián)合ATO能夠延長NOD/SCID-AML模型小鼠的生存時間
　　聯(lián)合用藥組小鼠生存時間與模型組比較有顯著性差異（P＜0.05），防風提取物組和ATO組無顯著性差異。各治療組小鼠生命延長率分別為

11、:單用ATO組36％，單用防風組37.3％，聯(lián)合用藥組51.8％。主要臟器病理切片顯示，與模型組相比，治療組臟器病變有不同程度減輕，腎臟較明顯。
　　結論:
　　1.防風提取物具有一定程度的抑制K562、HL-60細胞增殖的能力，其抑制作用呈濃度依賴性。
　　2.防風提取物能夠增強ATO對K562、HL-60細胞增殖的抑制作用。增強ATO對K562細胞的增殖抑制作用可能與協(xié)同ATO誘導K562細胞凋亡和S期細胞周期阻滯

12、有關。增強ATO對HL-60細胞的增殖抑制作用可能與協(xié)同ATO誘導HL-60細胞凋亡有關。
　　3.4～5周齡NOD/SCID小鼠尾靜脈注射3×106～1×107個HL-60細胞，無論是否接受60Co照射均能表現(xiàn)出全身白血病癥狀。這種方法建立的白血病小鼠模型是國內外評價藥物對白血病增殖、分化等作用機制研究的常用模型。
　　4.防風提取物具有增強ATO對NOD/SCID-AML小鼠模型的治療作用，并能改善小鼠臟器受損情況，該實