脂氧素A4對(duì)ARDS肺水清除和炎癥細(xì)胞的影響及機(jī)制研究.pdf

1、本研究分為三部分：
　　第一部分：脂氧素A4對(duì)健康志愿者與膿毒癥患者中性粒細(xì)胞的影響及機(jī)制
　　目的：比較脂氧素對(duì)健康志愿者與膿毒癥患者中性粒細(xì)胞的影響異同并探討其可能機(jī)制。
　　方法：分別抽取40位健康志愿者和膿毒癥患者血液分離中性粒細(xì)胞。脂氧素干預(yù)中性粒細(xì)胞1h后，以N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine(fMLP)和Interleukin(IL)-8為趨化劑檢測(cè)中性粒細(xì)胞的

2、趨化作用，檢測(cè)中性粒細(xì)胞凋亡情況，檢測(cè)中性粒細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)吞噬作用和細(xì)胞外吞噬作用(細(xì)胞外誘捕NETs)，檢測(cè)中性粒細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生，細(xì)胞表面標(biāo)記分子的表達(dá)以及COX-2，NF-κB蛋白表達(dá)情況。探討并比較脂氧素A4對(duì)健康志愿者和膿毒癥患者中性粒細(xì)胞的影響及具體機(jī)制。
　　結(jié)果：與空白對(duì)照組比較，脂氧素A4抑制志愿者和膿毒癥患者的趨化作用;促進(jìn)4h，24h中性粒細(xì)胞的凋亡;促進(jìn)中性粒細(xì)胞吞噬細(xì)菌能力和胞外誘捕能力;抑制活性氧的產(chǎn)生;降

3、低細(xì)胞表明粘附分子CD11a，CD16，CD63和內(nèi)毒素受體CD14的表達(dá);脂氧素A4抑制志愿者和膿毒癥患者中性粒細(xì)胞COX-2，NF-κB/P-P65的蛋白表達(dá)。脂氧素對(duì)膿毒癥患者的作用較健康志愿者更強(qiáng)，提示脂氧素在炎癥發(fā)生后促進(jìn)炎癥消退的作用更顯著。
　　結(jié)論：脂氧素通過調(diào)控中性粒細(xì)胞的趨化，凋亡，吞噬，活性氧產(chǎn)生，細(xì)胞表面標(biāo)記分子，COX-2，NF-κB/P-P65的蛋白表達(dá)，提示脂氧素A4可通過調(diào)控NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮炎

4、癥消退的作用。
　　第二部分：脂氧素A4對(duì)人原代肺泡巨噬細(xì)胞的影響及機(jī)制
　　目的：研究脂氧素對(duì)人原代肺泡巨噬細(xì)胞吞噬凋亡中性粒細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的影響并探討其可能機(jī)制。
　　方法：取來自30多位肺癌患者切除的肺組織，0.9％生理鹽水灌洗肺組織后分離肺泡巨噬細(xì)胞。不同劑量脂氧素A4(10，50，100，150，200 nM)，不同劑量HMGB1(10，50，100，150 ng)，脂多糖(lipopolysacc

5、haride，LPS)，BOC-2(脂氧素受體抑制劑，10μM)或LY294002(PI3K抑制劑，10μM)分別干預(yù)肺泡巨噬細(xì)胞24 h，96 h后，將CMFDA Green標(biāo)記的凋亡的中性粒細(xì)胞加入巨噬細(xì)胞中(4∶1)共培養(yǎng)90min后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡率。巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記分子標(biāo)記M1，M2型，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脂氧素對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的影響。
　　結(jié)果：與空白對(duì)照組比較，脂氧素A4組時(shí)間-劑量依賴性促進(jìn)人原代肺泡巨噬細(xì)胞吞

6、噬凋亡的中性粒細(xì)胞（P＜0.05）;與空白對(duì)照組相比，LPS抑制肺泡巨噬細(xì)胞吞噬率，HMGB1時(shí)間-劑量依賴性抑制肺泡巨噬細(xì)胞吞噬率（P＜0.05）;與LPS組相比，脂氧素A4治療組促進(jìn)肺泡巨噬細(xì)胞吞噬率（P＜0.05）;與HMGB1組相比，脂氧素A4治療組促進(jìn)肺泡巨噬細(xì)胞吞噬率（P＜0.05）;給予BOC-2(脂氧素受體抑制劑，10μM)或LY294002(PI3K抑制劑，10μM)后，脂氧素作用消失;治療性給予脂氧素A4上調(diào)P-P8

7、5蛋白表達(dá)。脂氧素還可促進(jìn)肺泡巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞M1型向M2型轉(zhuǎn)化，進(jìn)而促進(jìn)炎癥消退。
　　結(jié)論：脂氧素一方面通過脂氧素受體(ALX)----HMGB1---PI3K通路介導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞吞噬凋亡中性粒細(xì)胞，促進(jìn)炎癥消退;另一方面，脂氧素通過調(diào)控肺泡巨噬細(xì)胞從促進(jìn)炎癥發(fā)生的M1型向促進(jìn)炎癥消退的M2型轉(zhuǎn)化，發(fā)揮炎癥消退的作用。
　　第三部分：脂氧素A4對(duì)ARDS大鼠肺泡液體清除率的影響及機(jī)制
　　目的：研究

8、脂氧素對(duì)大鼠急性呼吸窘迫綜合征(Acute respiratory distress syndrome，ARDS)肺泡液體清除率的影響并探討其可能機(jī)制。
　　方法：在體實(shí)驗(yàn)部分，雄性SD大鼠(250-300 g)麻醉氣管插管后，靜脈給予0.03 ml/kg油酸建立急性呼吸窘迫綜合征模型后，脂氧素A4(2 ug/kg)、BML-111(脂氧素受體激動(dòng)劑，1 mg/kg)或BOC-2(脂氧素受體抑制劑，600 ng/kg)經(jīng)股靜脈注入

9、大鼠體內(nèi)，隨之5％Evans Blue-標(biāo)記的白蛋白(5 ml/kg)經(jīng)氣管導(dǎo)管緩慢泵入左肺，機(jī)械通氣1h后，腹主動(dòng)脈放血處死動(dòng)物。光鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化，測(cè)定肺組織TNF-α，髓過氧化物酶(MPO)，cAMP，cGMP含量;測(cè)定濕干重比值;回抽左側(cè)肺組織灌注液測(cè)定AFC;檢測(cè)肺組織勻漿鈉通道(ENaC)，Na，K-ATPase蛋白表達(dá)量以及Na，K-ATPase活性。此外，分離培養(yǎng)大鼠原代肺泡Ⅱ型上皮(ATⅡ)細(xì)胞，脂氧素A4(1

10、0-7 mol/L)與內(nèi)毒素(lipopolysaccharide，LPS1 ug/ml)干預(yù)細(xì)胞檢測(cè)ENaC蛋白和mRNA表達(dá)量以及Na, K-ATPase活性。
　　結(jié)果：在體實(shí)驗(yàn)中，與OA組比較，脂氧素A4治療組，BML-111預(yù)防組和治療組肺組織中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)減少、肺水腫減輕;肺組織TNF-α，MPO含量，濕干重比值明顯降低(P＜0.01); AFC明顯升高（P＜0.01）;肺組織ENaCα，γ亞基和Na，K-ATPase

11、β1亞基蛋白表達(dá)明顯增高(P＜0.05); Na，K-ATPase活性明顯增強(qiáng)(P＜0.01）;肺組織勻漿中cAMP含量未明顯變化（P＞0.05），但是cGMP含量明顯降低（P＜0.05）;給予Rp-cGMP(cGMP抑制劑，15μM)后，AFC增高;而給予BOC-2后，上述變化均消失。大鼠原代肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞中，與LPS(1ug/ml)組比較，脂氧素A4(10-7 mol/L)治療組ENaCα，γ亞基蛋白表達(dá)明顯增高，ENaCγ亞基m