促紅細(xì)胞生成素對(duì)腦白質(zhì)軟化新生鼠膠質(zhì)纖維酸性蛋白和神經(jīng)行為學(xué)的影響.pdf

1、研究背景:
　　隨著圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)及新生兒重癥監(jiān)護(hù)技術(shù)的發(fā)展，早產(chǎn)兒存活率較前明顯增加，隨之而來(lái)的是早產(chǎn)兒腦損傷的發(fā)病率的升高。這一問(wèn)題已愈來(lái)愈受到關(guān)注，早產(chǎn)兒腦損傷的發(fā)病機(jī)制已成為醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)。早產(chǎn)兒腦室周圍白質(zhì)軟化（periventricular leukomalacia，PVL）是早產(chǎn)兒最常見(jiàn)的腦損傷類型，可引起痙攣性腦性癱瘓、認(rèn)知及行為學(xué)異常等后遺癥。促紅細(xì)胞生成素（Erythropoietin，EPO）作為造血因子除了用于

2、早產(chǎn)兒貧血的治療外，在早產(chǎn)兒腦損傷中也具有神經(jīng)保護(hù)作用。故本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)3日齡SD大鼠單側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎+缺氧建立PVL模型的基礎(chǔ)上給予EPO進(jìn)行干預(yù)，從病理形態(tài)學(xué)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）免疫組織化學(xué)及遠(yuǎn)期神經(jīng)行為學(xué)試驗(yàn)檢測(cè)大鼠的神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能、情感能力和Y-迷宮刺激試驗(yàn)檢測(cè)學(xué)習(xí)和記憶情況從而探索EPO對(duì)PVL新生鼠的神經(jīng)保護(hù)作用。
　　目的:
　　通過(guò)對(duì)3日齡

3、新生鼠腦室周圍白質(zhì)軟化模型的建立探討EPO對(duì)早產(chǎn)腦白質(zhì)損傷鼠的神經(jīng)保護(hù)作用，為臨床早期干預(yù)早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷提供一定的理論依據(jù)。
　　方法:
　　150只3日齡（P3）SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組又分為實(shí)驗(yàn)1組（EPO治療組）和實(shí)驗(yàn)2組（PVL組）。對(duì)照組僅分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，不結(jié)扎不缺氧。實(shí)驗(yàn)組大鼠結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈，于術(shù)后在6％氧氣+94%氮?dú)饣旌蠚庵腥毖?.5小時(shí)。實(shí)驗(yàn)1組（EPO治療組）在實(shí)驗(yàn)組基礎(chǔ)上腹腔注射EP

4、O5000 U/kg而實(shí)驗(yàn)2組（PVL組）在實(shí)驗(yàn)組基礎(chǔ)上腹腔注射等量的生理鹽水。分別于術(shù)后3d、7d、14d、21d測(cè)量體質(zhì)量后斷頭取腦測(cè)量腦重量、腦質(zhì)量損傷百分比，石蠟包埋切片行常規(guī)HE染色、GFAP免疫組化，剩下的大鼠于生后30d進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)試驗(yàn)（懸吊試驗(yàn)、曠場(chǎng)試驗(yàn)）和Y-迷宮刺激試驗(yàn)分別檢測(cè)大鼠遠(yuǎn)期的神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能、情感能力和學(xué)習(xí)記憶情況。
　　結(jié)果:
　　1.行為學(xué)：對(duì)照組大鼠術(shù)后無(wú)明顯行為改變，PVL組和EPO組大

5、鼠缺血缺氧后均出現(xiàn)異常行為學(xué)改變，EPO組大鼠主要表現(xiàn)為嗜睡，較易激惹，部分鼠偏向一側(cè)爬行或不能翻身，吃奶及活動(dòng)稍減少，動(dòng)作不協(xié)調(diào)，PVL組不僅表現(xiàn)為嗜睡，易激惹，大多數(shù)鼠偏向一側(cè)爬行或不能翻身，吃奶及活動(dòng)明顯減少，有的可見(jiàn)全身發(fā)紺，躁動(dòng)不安，四肢抽動(dòng)，甚至死亡。
　　2.體質(zhì)量增長(zhǎng)：術(shù)后3d、7d及14d PVL組術(shù)后體質(zhì)量增長(zhǎng)明顯落后于EPO組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[術(shù)后3d：（9.8±0.62）比（11.7±0.80）、

6、（13.8±0.41），術(shù)后7d：（12.1±0.46）比（16.1±0.62）、（18.2±0.53），術(shù)后14d：（23.5±0.89）比（28.4±0.62）、（33.8±0.71），P均<0.05]；
　　3.腦質(zhì)量/體質(zhì)量：術(shù)后1d PVL組及EPO組大鼠腦質(zhì)量/體質(zhì)量均大于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（5.37±0.38）、（3.83±0.22）比（2.92±0.32），P<0.01]，術(shù)后21d PVL組及 EPO組

7、大鼠腦質(zhì)量/體質(zhì)量均小于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（2.61±0.11）、（2.81±0.07）比（3.70±0.05），P<0.01]；
　　4.腦質(zhì)量損傷%：PVL組和EPO組各時(shí)間點(diǎn)的腦質(zhì)量損傷%隨著日齡的增加而增大，且術(shù)后1d、7d及21d腦質(zhì)量損傷%均大于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[術(shù)后1d：（27.74±7.25）、（13.36±5.40）比（0.29±0.47），術(shù)后7d：（37.65±8.12）、（25.32±6

8、.51）比（0.37±0.17），術(shù)后21d：（40.95±11.34）、（34.38±10.37）比（0.18±0.08），P均<0.05]；
　　5.HE染色：HE染色示術(shù)后7d對(duì)照組結(jié)構(gòu)正常，皮質(zhì)下白質(zhì)及胼胝體神經(jīng)纖維束形態(tài)及走向清晰，PVL組可見(jiàn)皮質(zhì)下及胼胝體結(jié)構(gòu)松散，胼胝體神經(jīng)纖維束紊亂、呈現(xiàn)疏松網(wǎng)狀，EPO治療組皮質(zhì)下結(jié)構(gòu)基本正常，胼胝體神經(jīng)纖維束走向較清晰，胼胝體神經(jīng)纖維束結(jié)構(gòu)基本正常；術(shù)后21d對(duì)照組側(cè)腦室正常，E

9、PO組側(cè)腦室三角區(qū)稍微擴(kuò)大，PVL組側(cè)腦室三角區(qū)擴(kuò)大明顯；
　　6.免疫組織化學(xué)：免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示術(shù)后3d與對(duì)照組、EPO組相比 PVL組GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目出現(xiàn)增多（P<0.05），術(shù)后7d與對(duì)照組相比EPO組和PVL組GFAP陽(yáng)性細(xì)胞均明顯增多（P<0.05），且PVL組增多更為明顯（P<0.05）；術(shù)后14d EPO組與PVL組GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)開(kāi)始回落，但仍多于對(duì)照組（P<0.05）， PVL組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)仍然比EPO組

10、多（P<0.05），術(shù)后21d各組GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)基本回落至正常水平；
　　7.神經(jīng)行為學(xué)試驗(yàn):神經(jīng)行為學(xué)試驗(yàn)懸吊試驗(yàn)中PVL組鼠大部分反應(yīng)遲鈍，很少有肢體活動(dòng)，極易從玻璃棒上掉下，PVL組及EPO組大鼠懸吊試驗(yàn)的分?jǐn)?shù)均低于對(duì)照組大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（1.00±0.76）、（2.38±0.91）比（3.87±0.83），P<0.05]，曠場(chǎng)試驗(yàn)中PVL組鼠大部分行為及其遲緩，穿越方格數(shù)很少，分?jǐn)?shù)均低于對(duì)照組及EPO組且具有統(tǒng)

11、計(jì)學(xué)意義[（5.00±1.20）比（7.37±0.92）、（10.12±1.24），P<0.05]；
　　8.Y迷宮試驗(yàn):Y迷宮試驗(yàn)中PVL組及EPO組所需訓(xùn)練次數(shù)較對(duì)照組多且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[（31.25±2.60）、（25.1±1.89）比（19.63±3.38），P<0.05]，24小時(shí)后記憶保持率 PVL組相比 EPO組、對(duì)照組低且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（43.0±5.65）比（56.4±9.18）、（75.4±5.51），P<

12、0.05]，以PVL組24小時(shí)后記憶保持率最低。
　　結(jié)論:
　　1.通過(guò)對(duì)3日齡SD大鼠行單側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎+缺氧2.5h可成功構(gòu)建PVL模型；
　　2.腦白質(zhì)軟化時(shí)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)增加，且損傷后3d開(kāi)始出現(xiàn)，7d達(dá)高峰期，損傷后21天基本回落至低表達(dá)水平；
　　3.EPO能減少腦白質(zhì)軟化后GFAP陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)，在神經(jīng)細(xì)胞損傷的修復(fù)中起到一定的作用；
　　4. EPO能在一定程度上改善腦白質(zhì)軟化后大鼠