基因BC023882發(fā)育學(xué)表達(dá)模式、亞細(xì)胞定位及其對細(xì)胞周期的影響.pdf

1、研究背景 前期課題“高密度cDNA基因芯片篩選小鼠腦發(fā)育、損傷相關(guān)基因的研究”利用含小鼠發(fā)育文庫cDNA7680條的高密度基因芯片，對發(fā)育和損傷模型中表達(dá)差異的基因進(jìn)行篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)育過程中高表達(dá)基因560個，其中過度表達(dá)有34個。這些基因功能廣泛，涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞代謝、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞骨架、DNA復(fù)制修復(fù)、細(xì)胞粘附等17類。其中一個功能未知的過度表達(dá)基因BC023882引人注目，它在胚胎發(fā)育和生后早期小鼠的腦組織存

2、在高表達(dá)，其中POd時相點Cy5/Cy3比值(Ratio值)為7.6038，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于2.0000的基因表達(dá)差異篩選標(biāo)準(zhǔn)。提示基因BC023882可能在小鼠早期胚胎中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中起到重要作用。 研究方法與結(jié)果 1.基因BC023882的發(fā)育學(xué)表達(dá)模式及腦區(qū)定位。 (1)半定量RT-PCR檢測基因BC203882在發(fā)育小鼠各個階段的表達(dá)情況。 分別取小鼠胚胎期時相點(E14、E19d)及生后發(fā)育時相

3、點(P1、P7、P14、P30、P60d)的小鼠組織。其中胚胎期組織包括腦(brain)和胚體(body)，而生后組織包括腦、肝、腎、心、肺和小腸。分別提取上述組織的總RAN，利用RT-PCR技術(shù)檢測基因023882在上述組織中的表達(dá)。我們通過RT-PCR實驗觀察到基因BC023882的mRNA呈階段性地表達(dá)于腦組織，P1d達(dá)到高峰，P60d表達(dá)消失；其mRNA也少量表達(dá)于胚體組織，具體定位有待進(jìn)一步實驗確定；另外P1d肝組織也有微弱表

4、達(dá)，隨后迅速消失，而腎臟、肺、小腸和心臟等組織均未檢測到該基因表達(dá)。 (2)用原位雜交技術(shù)檢測基因BC023882的mRNA在不同腦區(qū)中的定位。 根據(jù)基因BC023882的特異性序列設(shè)計RT-PCR引物，擴(kuò)增后構(gòu)建在含T7啟動子的pcDNA3.1(-)載體中，標(biāo)記cRNA探針。利用該基因探針對各實驗組腦組織進(jìn)行原位雜交。通過組織原位雜交實驗觀察：基因BC023882的mRNA的最早出現(xiàn)在E14d的胚胎腦組織大腦皮層，包括

5、運動皮層、軀體感覺皮層、扣帶皮質(zhì)和梨狀皮質(zhì)；P1d時雜交陽性細(xì)胞出現(xiàn)范圍更廣，如大腦皮層，內(nèi)囊、胼胝體、視前區(qū)諸核團(tuán)等等；雜交信號在P1d出現(xiàn)高峰，P7d明顯減弱，P30d完全消失；基因BC023882的mRNA主要定位在細(xì)胞核內(nèi)，而皮層的少數(shù)神經(jīng)元的胞漿內(nèi)也有出現(xiàn)，神經(jīng)細(xì)胞的胞體中未見陽性出現(xiàn)。 2.基因BC023882融合蛋白的亞細(xì)胞定位。 我們成功構(gòu)建了BC023882-EGFP融合蛋白真核表達(dá)載體，將該真核表達(dá)載

6、體導(dǎo)入COS-7細(xì)胞、NIH3T3細(xì)胞及EFC細(xì)胞。分別經(jīng)過高爾基體特異性熒光染料BODIPY-TR及PI染色，經(jīng)過熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)BC023882-EGFP融合蛋白主要定位在以上幾種細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)，BC023882-EGFP融合蛋白在胞漿也有較弱的彌散性分布，并且該融合蛋白少數(shù)情況下也單獨出現(xiàn)在細(xì)胞的胞漿；胞漿表達(dá)的BC023882-EGFP融合蛋白并不局限于細(xì)胞的高爾基體區(qū)域，僅僅在高爾基體上出現(xiàn)較弱的共聚表達(dá)。

7、 3.BC023882基因?qū)?xì)胞周期的影響 我們構(gòu)建了BC023882的全長表達(dá)質(zhì)粒，并且通過篩選獲得了穩(wěn)定表達(dá)基因BC023882的COS-7細(xì)胞。利用帶有EGFP標(biāo)記的psUGI載體構(gòu)建了兩個siRNA質(zhì)粒，將載體V1導(dǎo)入后，根據(jù)RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)能夠86％抑制BC023882+-COS7細(xì)胞中基因BC023882的表達(dá)。細(xì)胞生長曲線繪制及流式細(xì)胞儀觀察發(fā)現(xiàn)：抑制基因BC023882表達(dá)后，RNA干擾后細(xì)胞的較對照

8、組BC023882+-COS7細(xì)胞生長速度加快，并且細(xì)胞周期中GO+G1期細(xì)胞減少，S期和G2+M期細(xì)胞增多，細(xì)胞分裂過程受到促進(jìn)；然而未能達(dá)到正常組COS-7細(xì)胞的增殖狀況。 結(jié)論 1.基因BC023882的mRNA較為特異性的限制表達(dá)于胚胎及發(fā)育早期的小鼠腦組織內(nèi)，在胚胎期胚體組織和生后早期的肝臟組織也有微弱的表達(dá)。并且基因BC023882的mRAN在腦區(qū)的定位分布也顯示了較大的區(qū)域特異性，原位雜交的陽性信號主要出現(xiàn)

9、在腦組織的皮層各個部位，此外還集中于下丘腦(如視前區(qū)核團(tuán))以及內(nèi)囊，胼胝體等處的神經(jīng)纖維，其他腦區(qū)少見陽性的出現(xiàn)。另外，基因BC023882的mRNA的表達(dá)也呈明顯的時間依賴模式，一過性地短暫出現(xiàn)在小鼠發(fā)育的胚胎期和生后早期，隨后迅速減弱并消失。 2.通過對BC023882-EGFP融合蛋白的亞細(xì)胞定位觀察，我們認(rèn)為基因BC023882表達(dá)的蛋白質(zhì)可能是一種核蛋白；它并不定位在細(xì)胞的高爾基體上，因此不屬于Golgin蛋白家族的成

10、員。 3.通過基因BC023882的細(xì)胞轉(zhuǎn)染和RNA干擾實驗的結(jié)果，我們認(rèn)為基因BC023882能夠抑制COS-7細(xì)胞的有絲分裂，減慢細(xì)胞的增殖速度；而抑制轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞內(nèi)基因BC023882表達(dá)則能夠使得這種細(xì)胞周期阻滯現(xiàn)象得到一定程度的緩解，部分恢復(fù)轉(zhuǎn)染前正常COS-7細(xì)胞的生長狀態(tài)。 假說：通過以上結(jié)論我們得到如下假說，即小鼠基因BC023882是一種發(fā)育早期中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異性表達(dá)的基因；基因BC023882在一定程