豬溶素誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生炎癥因子的分子機(jī)制研究.pdf

1、豬鏈球菌可以引起豬腦膜炎,是世界公認(rèn)可引起動(dòng)物傳染病的重要病原體。作為一種人畜共患病病原菌,豬鏈球菌感染人類(lèi)的散發(fā)病例(主要是腦膜炎)在過(guò)去的四十五年已有報(bào)道。在2005年,中國(guó)報(bào)道超過(guò)200人感染豬鏈球菌,病死率高達(dá)20％。死亡病例表現(xiàn)為罕見(jiàn)的中毒性休克樣綜合征(TSLS),而且這類(lèi)病人血清中細(xì)胞因子(IL-1β,IL-6,IL-8,IL-12p70,IFN-γ和TNF-α)水平明顯高于臨床表現(xiàn)為單純腦膜炎的病人。這些細(xì)胞因子的過(guò)量釋

2、放可能是引起TSLS的重要原因。
　　眾多國(guó)外學(xué)者發(fā)現(xiàn),歐洲的豬鏈球菌致病株31533經(jīng)過(guò)熱滅活性后,可以激活人類(lèi)單核細(xì)胞系THP-1以及小鼠巨噬細(xì)胞系J774A1和P388D1,釋放大量的細(xì)胞因子。細(xì)菌的細(xì)胞壁成分及其毒力因子豬溶素(SLY)可以激活內(nèi)皮細(xì)胞釋放細(xì)胞因子。純化的重組SLY蛋白可以刺激人單核細(xì)胞釋放TNF-α,也可以刺激豬PAMs釋放IL-6。
　　在中國(guó)引起暴發(fā)流行的豬鏈球菌為ST7型,與歐洲流行株ST1型

3、相比,ST7型對(duì)人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的毒性較強(qiáng);而且SLY蛋白在我國(guó)的ST7型菌株中表達(dá)量高于ST1型,是重要的毒力因子。本研究通過(guò)毒力基因篩選,發(fā)現(xiàn)SLY是中國(guó)流行株中引起宿主產(chǎn)生炎癥因子的重要毒力蛋白。SLY由497個(gè)氨基酸殘基組成,歸屬于依賴(lài)膽固醇的細(xì)胞溶素(CDC)家族;CDC家族目前具有23個(gè)成員,包括產(chǎn)氣莢膜梭菌釋放的外毒素(PFO),以及化膿性鏈球菌釋放的外毒素(SLO)。CDC家族所有成員都是由革蘭氏陽(yáng)性菌釋放

4、的一種外毒素,他們共同的特征是可以在富含膽固醇的細(xì)胞膜上打孔從而引起細(xì)胞通透性改變或者導(dǎo)致細(xì)胞裂解。據(jù)報(bào)道,SLY可以在人紅細(xì)胞表面打孔,形成直徑約為7nm的小孔,從而引起紅細(xì)胞裂解,即我們通常所說(shuō)的溶血。
　　以2005年分離的中國(guó)豬鏈球菌致病株05ZY為模板,本室構(gòu)建了多株毒力基因缺失突變株。本研究首先通過(guò)構(gòu)建細(xì)胞模型,對(duì)缺失突變株進(jìn)行篩選,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明野生菌株05ZY可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子,sly基因敲除后,不能誘導(dǎo)內(nèi)

5、皮細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子。緊接著,對(duì)其編碼的蛋白進(jìn)行純化和鑒定;深入研究了SLY蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子的機(jī)制。
　　隨后,選用了PBMC、THP-1MΦ、RAW264.7和小鼠腹腔分離的原代巨噬細(xì)胞為細(xì)胞模型,對(duì)SLY的作用進(jìn)行深入研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PBMC對(duì)SLY蛋白敏感性強(qiáng)于巨噬細(xì)胞,具體表現(xiàn)為低濃度的SLY即可誘導(dǎo)PBMC產(chǎn)生高濃度TNF-α。由于細(xì)胞碎片也可以誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子,本研究還構(gòu)建了重組SLY蛋白(rSLY)以及完

6、全缺失溶血活性的點(diǎn)突變蛋白(P353V),進(jìn)一步研究SLY的作用是否依賴(lài)其溶血活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SLY的作用不依賴(lài)其溶血活性,很可能是被宿主重要模式識(shí)別受體識(shí)別,從而導(dǎo)致炎癥因子的釋放。
　　國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn),均證明了SLY可以誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生炎癥因子,但是卻沒(méi)有進(jìn)一步的深入研究其機(jī)制。作者通過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研,發(fā)現(xiàn)同家族的PLY(肺炎鏈球菌分泌的外毒素)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子通過(guò)TLR4受體發(fā)揮作用。SLY是否與PLY有相似的

7、作用值得進(jìn)一步研究。本研究應(yīng)用了多種受體抑制劑,結(jié)果發(fā)現(xiàn)TLR4特異性抑制劑可以完全抑制SLY對(duì)多種細(xì)胞的作用,推測(cè)SLY的作用很可能依賴(lài)于TLR4受體。緊接著,本研究引入了TLR4點(diǎn)突變小鼠,結(jié)果顯示,SLY誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子依賴(lài)于TLR4受體。
　　隨后,應(yīng)用MyD88、TRIF以及MAPKs特異性抑制劑來(lái)分析SLY-TLR4的下游信號(hào)通路。結(jié)果顯示,MyD88是SLY發(fā)揮作用的重要胞內(nèi)接頭蛋白分子。而p38-MAPK抑制劑

8、可以完全抑制SLY對(duì)PBMCs的作用。應(yīng)用westernblot檢測(cè)技術(shù)來(lái)分析SLY對(duì)細(xì)胞MAPKs的直接激活情況,結(jié)果表明SLY在短時(shí)間內(nèi)即可直接激活PBMCs細(xì)胞內(nèi)的p38-MAPK分子。最后利用熒光素報(bào)告基因檢測(cè)技術(shù)來(lái)研究SLY對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的激活作用,結(jié)果表明SLY可以激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB。NF-κB激活后從胞漿內(nèi)進(jìn)入細(xì)胞核,從而調(diào)控炎癥因子的表達(dá)。
　　雖然有報(bào)道稱(chēng)熱滅活的歐洲菌株31533可以激活單核巨噬細(xì)胞釋放多種炎癥

9、因子。但是細(xì)菌的濃度必須達(dá)到109cfu/ml才可以誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生高水平的炎癥因子,當(dāng)細(xì)菌濃度降至108cfu/ml時(shí),TNF的水平很快降落下來(lái)。TNF是最早被檢測(cè)的細(xì)胞因子,其動(dòng)力學(xué)分析顯示,其水平可于5小時(shí)內(nèi)迅速降至基線(xiàn)水平。而國(guó)外學(xué)者從31533提取的細(xì)胞壁成分,濃度高達(dá)150ug/ml才可以誘導(dǎo)THP-1MΦ細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α,本研究應(yīng)用SLY濃度為100ng/ml時(shí)激活THP-1MΦ產(chǎn)生TNF-α水平與其相當(dāng)。值得一提的是,12

10、.5ng/ml的SLY蛋白即可誘導(dǎo)PBMCs產(chǎn)生大量TNF-α,并且此效應(yīng)可以持續(xù)長(zhǎng)達(dá)36小時(shí)。
　　本研究中所用的細(xì)胞模型包括單核巨噬細(xì)胞(THP-1MΦ,RAW264.7,小鼠來(lái)源的原代腹腔巨噬細(xì)胞)和PBMC。結(jié)果顯示PBMC對(duì)SLY的敏感性明顯高于巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞主要位于不同組織中,屬于人體第一道防線(xiàn)的免疫細(xì)胞,此部位發(fā)生炎癥反應(yīng)通過(guò)炎癥因子的釋放,可以幫助機(jī)體有效清除病原菌,將感染控制在局部。但是,細(xì)菌一旦進(jìn)入血液中將

11、會(huì)是致命的,因?yàn)?mol/L的SLY蛋白短時(shí)間內(nèi)即可誘導(dǎo)PBMC產(chǎn)生大量TNF-α,這種全身性釋放TNF-α可以引起休克。而在中國(guó)的豬鏈球菌病人血中可以輕易分離出該菌。所以SLY蛋白與PBMC的相互作用應(yīng)當(dāng)引起足夠的重視。
　　由于LPS可通過(guò)TLR4受體激活免疫細(xì)胞,釋放炎癥因子。因此本研究運(yùn)用多種手段排除內(nèi)毒素LPS的影響。
　　第一,基于LPS的熱穩(wěn)定性,作者對(duì)天然SLY蛋白進(jìn)行加熱處理,再與細(xì)胞共孵育;
　　第

12、二,基于多粘菌素B可以使LPS失去誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子的作用,作者將蛋白與多粘菌素B在4℃提前作用1小時(shí),再與細(xì)胞共孵育;
　　第三,本研究運(yùn)用Ttritoon X-114抽提去除重組蛋白中的LPS,使內(nèi)毒素的含量符合國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)(<5EU/mg);
　　最后,應(yīng)用無(wú)關(guān)蛋白做對(duì)照,無(wú)關(guān)蛋白是豬鏈球菌的細(xì)胞壁蛋白,其誘導(dǎo)表達(dá)純化與去除LPS過(guò)程與rSLY和P353V均一致。
　　經(jīng)過(guò)以上處理后,實(shí)驗(yàn)結(jié)果均證明,SLY可以誘導(dǎo)

13、細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子。
　　本研究首次揭示出SLY蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子不依賴(lài)其溶血活性,并且此作用通過(guò)TLR4受體介導(dǎo)。S.suis與宿主相互作用具有雙刃劍的作用。S.suis分泌的毒力蛋白SLY具有溶血活性可以對(duì)真核細(xì)胞造成直接損傷,而SLY誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子的作用又可以激活機(jī)體的免疫反應(yīng),從而幫助宿主清除病原菌。但是若S.suis分泌的SLY蛋白激活真核細(xì)胞過(guò)度釋放炎癥因子,則宿主容易發(fā)生TSLS。
　　SLY蛋白誘導(dǎo)