錦囊升白沖劑對(duì)放化療后骨髓抑制再生的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的:全球癌癥病人發(fā)病率及死亡率呈逐年上升趨勢，手術(shù)、放療和化療仍是臨床上治療腫瘤的三大主要手段，而晚期癌癥病人及非實(shí)體瘤病人大多只能選擇放、化療治療。骨髓抑制是放、化療最常見的毒副反應(yīng)，主要表現(xiàn)為白細(xì)胞減少，甚至可使全血細(xì)胞減少，嚴(yán)重影響了患者的治療效果。因此，如何有效增強(qiáng)骨髓抑制后再生是臨床上腫瘤治療中決定成敗的一個(gè)焦點(diǎn)問題。
　　 臨床上常用的升白細(xì)胞藥物有兩大類。西藥有以粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)為主的一類藥。國家

2、藥監(jiān)局已批準(zhǔn)上市的中藥類有:地榆升白片、復(fù)方皂礬丸、升白合劑等十余種。因其各有弊端使它們?cè)谂R床的應(yīng)用中受到局限。
　　 錦囊升白沖劑系齊錦生教授多年臨床隨訪觀察經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，療效顯著，總有效率可達(dá)94％。是耐受放、化療治療極具臨床開發(fā)前景的升白細(xì)胞新藥。
　　 骨髓抑制后再生的細(xì)胞基礎(chǔ)是造血干細(xì)胞(Hematopoieticstemcell，HSC)，HSC通過不斷的自我更新，不僅維持自身數(shù)量的恒定，且通過分化成各系祖細(xì)胞滿

3、足外周血造血需求。近年來研究發(fā)現(xiàn)一些內(nèi)在因素對(duì)HSC自我更新具有強(qiáng)大的調(diào)控能力，如經(jīng)典的WNT信號(hào)途徑、NOTCH信號(hào)途徑、同源盒(HOX)轉(zhuǎn)錄因子家族等可以調(diào)控HSC的自我更新能力。目前認(rèn)為，NOTCH和WNT信號(hào)通路之間存在相互聯(lián)系和協(xié)調(diào)平衡，WNT信號(hào)通路的高度活化是造血祖細(xì)胞增殖的重要條件，NOTCH通路對(duì)于維持造血祖細(xì)胞的未分化狀態(tài)和休眠是必須的。HOX基因是同源盒基因(homeoboxgene)家族中的一員，是一類在進(jìn)化上高

4、度保守的基因，HOX基因不僅調(diào)控正常造血增殖分化過程，其異常表達(dá)與白血病密切相關(guān)。此外一些小分子介質(zhì)，如前列腺素E2(PGE2)，在調(diào)節(jié)HSC自我更新上起著重要化學(xué)調(diào)節(jié)作用，PGE2和WNT信號(hào)通路相互作用，通過活化WNT信號(hào)通路促進(jìn)HSC的自我更新。
　　 在錦囊升白沖劑安全有效的臨床應(yīng)用基礎(chǔ)上，本研究通過檢測大量受輻射后白細(xì)胞減少的小鼠飲用錦囊升白沖劑后，外周血白細(xì)胞的變化，證明其有顯著升高白細(xì)胞作用后;采用PCR和West

5、ernblotting技術(shù)篩查各組小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞調(diào)節(jié)造血信號(hào)通路的基因:β-Catenin、NOTCH1、JAGGED1、HOXB4、COX2的mRNA水平和蛋白含量的變化，以探求白細(xì)胞減少癥模型小鼠飲用錦囊升白沖劑后外周血白細(xì)胞升高的機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)還應(yīng)用PGE2合成酶COX2的特異性抑制劑celecoxib(塞來昔布)，通過抑制PGE2的合成，以探求錦囊升白沖劑在促進(jìn)小鼠造血功能恢復(fù)過程中，是否是通過PGE2作用于WNT信號(hào)通路而發(fā)

6、揮主要作用。
　　 為了進(jìn)一步探求錦囊升白組方的有效成份亦或存在起效的單體成份，對(duì)該組方進(jìn)行了分離純化，這對(duì)闡明該藥物作用分子機(jī)制和開發(fā)有重要意義。
　　 第一部分.錦囊升白沖劑對(duì)放化療后骨髓抑制再生的分子機(jī)制研究方法:
　　 1.動(dòng)物分組與取材
　　 健康雄性小鼠(20±5g)140只，昆明種，隨機(jī)分為五組:地榆升白組、錦囊升白組、塞來昔布+錦囊升白組（塞+錦組）、病理對(duì)照組、正常對(duì)照組。正常對(duì)照組小鼠

7、20只，余四組每組30只。前四組共120只小鼠（1％戊巴比妥鈉腹腔麻醉后，直線加速器X線照射小鼠后肢雙側(cè)股骨，距離100cm，總劑量為4Gy，照射后1天檢測白細(xì)胞，白細(xì)胞降至5×109.L-1以下為造模成功），造模成功后小鼠80只，每組20只。以上五組正常飲食喂養(yǎng)，病理對(duì)照組和正常對(duì)照組自由飲水，前三組（地榆升白組給予地榆升白片、錦囊升白組給予錦囊升白沖劑、塞+錦組給予錦囊升白沖劑+塞來昔布膠囊）按人與動(dòng)物單位體重折算的等效劑量計(jì)算小鼠

8、的每日用藥量，以小鼠每天的生理需水量溶解，配成相應(yīng)濃度的藥液給小鼠飲用，連續(xù)給藥8天。
　　 2.小鼠外周血細(xì)胞的檢測和血清中PGE2值檢測
　　 小鼠在室溫20-25℃下喂養(yǎng)，給藥第4天、第8天，每組取20只小鼠以內(nèi)眥取血法采集小鼠抗凝血20μl，用血細(xì)胞分析器檢測外周血細(xì)胞數(shù)值，同時(shí)在給藥第8天每組取20只小鼠以內(nèi)眥取血法，每只小鼠采抗凝血200μl，室溫自然凝固后取血清測PGE2值。
　　 3.骨髓單個(gè)核細(xì)

9、胞β-Catenin、NOTCH1、JAGGED1、HOXB4、COX2的轉(zhuǎn)錄水平的檢測
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后頸椎脫臼分組處死小鼠后，用淋巴細(xì)胞分離液分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞，收集細(xì)胞后用于提取總RNA和蛋白用于PCR和Westernblotting等分子生物學(xué)檢測。Trizol法提取骨髓單個(gè)核細(xì)胞中總RNA，用β-actin做內(nèi)參，PCR法檢測β-Catenin、NOTCH1、JAGGED1、HOXB4、COX2的mRNA表達(dá)。

10、　　 4.骨髓單個(gè)核細(xì)胞β-Catenin、JAGGED1、HOXB4、COX2的蛋白含量
　　 用Lowry法測定蛋白含量，Westernblotting檢測骨髓中β-Catenin、JAGGED1、HOXB4、COX2的蛋白含量。
　　 隨后對(duì)錦囊升白組方進(jìn)行進(jìn)一步分離純化，再用各分離純化得到的組分給造模成功后的小鼠飲用，觀察各組分的有效性，從而尋求該中藥組方的有效作用部位。并用分離純化后得到的有效組份進(jìn)行二極管陣

11、列檢測器和蒸發(fā)光檢測器檢測，通過定性分析以求明確其有效成份。
　　 結(jié)果:
　　 1.小鼠的一般表現(xiàn)，錦囊升白沖劑對(duì)小鼠外周血白細(xì)胞和狀態(tài)的影響
　　 給藥第4天，地榆升白組（6.8±2.84）、錦囊升白組(5.47±1.79)較病理對(duì)照組(4.82±2.11)外周血白細(xì)胞數(shù)顯著升高(P＜0.05）。錦囊升白組較地榆升白組小鼠活動(dòng)性強(qiáng)，被毛順滑更有光澤。塞+錦組(3.85±0.79)與病理對(duì)照組(4.82±2.1

12、1)相比白細(xì)胞計(jì)數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。塞+錦組(3.85±0.79)和病理對(duì)照組一般狀態(tài)最差，動(dòng)物開始活動(dòng)減少，精神萎靡，閉目，尾、耳顏色蒼白，被毛粗亂、蓬松且無光澤，體重隨飲食量減少而下降。給藥第8天地榆升白組（8.0±3.01）、錦囊升白組(7.99±2.75)較病理對(duì)照組(4.74±2.36)外周血白細(xì)胞數(shù)有顯著差異(P＜0.05)。塞+錦組(3.77±1.74)與病理對(duì)照組(4.74±2.36)相比白細(xì)胞計(jì)數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　

13、 2.小鼠血清PGE2濃度檢測
　　 ELISA法檢測小鼠血清PGE2濃度結(jié)果:錦囊升白組、地榆升白組和病理對(duì)照組相比PGE2濃度明顯增高(P＜0.05）。塞+錦組與病理對(duì)照組無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 3.骨髓單個(gè)核細(xì)胞β-Catenin、NOTCH1、JAGGED1、HOXB4、COX2轉(zhuǎn)錄水平的變化
　　 地榆升白組COX2的mRNA表達(dá)(0.1194±0.00795)和錦囊升白組COX2的mRNA表達(dá)(0

14、.0953±0.01274)相對(duì)病理對(duì)照組(0.0377±0.00564)均明顯增高。錦囊升白組的JAGGED1mRNA表達(dá)(0.2628±0.01855)相對(duì)病理對(duì)照組(0.0429±0.00704)明顯增高。錦囊升白組β-Catenin的mRNA表達(dá)(0.3935±0.12128)相對(duì)病理對(duì)照組(0.423±0.0186)，無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。錦囊升白組HOXB4的mRNA表達(dá)(0.0795±0.01407)相對(duì)正常對(duì)照組(0.075

15、7±0.0135)，無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 4.骨髓單個(gè)核細(xì)胞β-Catenin、JAGGED1、HOXB4、COX2蛋白含量的變化
　　 地榆升白組COX2的蛋白表達(dá)(0.7963±0.099)和錦囊升白組COX2的蛋白表達(dá)(0.7074±0.0842)相對(duì)病理對(duì)照組(0.2697±0.0324)有顯著差異(P＜0.01)。錦囊升白組(0.4901±0.0308)、塞+錦組(0.2433±0.0129)的JAGGED

16、1的蛋白表達(dá)相對(duì)病理對(duì)照組(0.1017±0.0078)有顯著差異(P＜0.01)。地榆升白組的β-Catenin蛋白表達(dá)(0.8366±0.1143)和錦囊升白組β-Catenin的蛋白表達(dá)(0.4268±0.0352)相對(duì)病理對(duì)照組(0.0979±0.0151)，有顯著差異(P＜0.01）。錦囊升白組的HOXB4蛋白表達(dá)(0.203±0.013)相對(duì)正常對(duì)照組(0.2249±0.0193)無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 第二部分.

17、錦囊升白組方有效成份的分離方法:
　　 1.錦囊升白組方有效成份的分離、純化
　　 中藥水煎后水相部分加有機(jī)溶劑萃取，藥渣部分用適量95％乙醇浸泡24小時(shí)后藥液倒出留用，藥渣部分再用同等量95％乙醇浸泡10小時(shí)，兩次的藥液為乙醇相，乙醇相60-65℃懸蒸濃縮2小時(shí)，再用水浴鍋干燥后放入烤箱80℃進(jìn)一步干燥為粉末。有機(jī)溶劑萃取:第一步:加常壓下沸程為60-90℃石油醚萃取兩次，石油醚相40-45℃懸蒸濃縮2小時(shí)，再用水浴鍋

18、干燥后放入烤箱80℃進(jìn)一步干燥為粉末。第二步:石油醚萃取后水相部分加沸點(diǎn)為61℃的氯仿萃取兩次，氯仿相40-45℃懸蒸濃縮2小時(shí)，再用水浴鍋干燥后放入烤箱80℃進(jìn)一步干燥為粉末。第三步:氯仿萃取后水相部分加乙酸乙酯萃取兩次，乙酸乙酯相40-45℃懸蒸濃縮2小時(shí)，再用水浴鍋干燥后放入烤箱80℃進(jìn)一步干燥為粉末。第四步:乙酸乙酯萃取后水相部分用正丁醇萃取兩次，正丁醇相70-78℃懸蒸濃縮2小時(shí)，再用水浴鍋干燥后放入烤箱80℃進(jìn)一步干燥為粉末

19、。正丁醇萃取后水相部分用水浴鍋干燥后放入烤箱80℃進(jìn)一步干燥為粉末。
　　 2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組
　　 健康雄性小鼠(20±5g)230只，昆明種，隨機(jī)分為八組:石油醚組、氯仿組、乙酸乙酯組、正丁醇組、水相組、乙醇組、病理對(duì)照組、正常對(duì)照組。正常對(duì)照組每組20只，余七組每組30只。前七組共210只小鼠(1％戊巴比妥鈉腹腔麻醉后，直線加速器放射源照射小鼠后肢雙側(cè)股骨，距離100cm，總劑量為4Gy，照射后1天檢測白細(xì)胞，白細(xì)

20、胞降至5×109.L-1以下為造模成功）。造模成功后前七組每組選取小鼠20只，以上八組正常飲食喂養(yǎng)，病理對(duì)照組和正常對(duì)照組自由飲水，前六組（石油醚組、氯仿組、乙酸乙酯組、正丁醇組、水相組、乙醇組）按人與動(dòng)物單位體重折算的等效劑量計(jì)算小鼠的用藥量，以小鼠每天的生理需水量溶解，配成相應(yīng)濃度的藥液給小鼠飲用，連續(xù)給藥8天。
　　 3.小鼠外周血細(xì)胞的檢測
　　 給藥第8天每組取20只小鼠采內(nèi)眥靜脈抗凝血20μl，用血細(xì)胞自動(dòng)計(jì)

21、數(shù)儀檢測外周血細(xì)胞變化。
　　 4液相色譜檢測器檢測已分離物質(zhì)
　　 取氯仿相、乙酸乙酯相、水相組三相物質(zhì)用二極管陣列檢測器檢測是否存在紫外吸收的化合物，用蒸發(fā)光檢測器檢測沒有紫外吸收的有機(jī)物質(zhì)。
　　 結(jié)果:
　　 1.小鼠的一般表現(xiàn)，錦囊升白組方各分離成份對(duì)小鼠外周血白細(xì)胞和狀態(tài)的影響
　　 給藥第8天，氯仿組(11.97±4.65)、乙酸乙酯組(12.44±5.13)、水相組(17.39±6

22、.38)較病理對(duì)照組(4.27±2.12)外周血白細(xì)胞數(shù)上升差值顯著升高(P＜0.05）。氯仿組、乙酸乙酯組、水相組較病理對(duì)照組小鼠活動(dòng)性強(qiáng)，被毛順滑更有光澤。石油醚組(6.61±1.96)、正丁醇組(5.29±1.79)、乙醇初提組(7.2±2.78)與病理對(duì)照組(4.27±2.12)相比白細(xì)胞計(jì)數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這幾組動(dòng)物開始活動(dòng)減少，精神萎靡，閉目，尾、耳顏色蒼白，被毛粗亂、蓬松且無光澤，體重隨飲食量減少而下降。
　　 2.

23、藥物分離純化后成分的定性分析
　　 二極管陣列檢測器（選200-400波長）檢測表明:氯仿、乙酸乙酯、水相三個(gè)組無明顯區(qū)別，波型類似，不存在紫外吸收物質(zhì)。蒸發(fā)光檢測器515X2(alteeh)檢測不揮發(fā)分子，確定不存在紫外吸收物質(zhì)（多糖無紫外吸收）;醇沉為5000以上大分子，沉的不多，其大部分物質(zhì)為5000以下的小分子量多糖。
　　 結(jié)論:
　　 1.錦囊升白沖劑使骨髓抑制后的小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)顯著升高。