體外激活的免疫增強細胞對于放化療所導致骨髓抑制的恢復作用.pdf

1、背景： 目前惡性腫瘤已成為嚴重危害人類健康的疾病，在現(xiàn)階段常規(guī)的臨床治療惡性腫瘤過程中，大部分患者曾接受或即將接受放療及化療。但惡性腫瘤患者接受放化療后，特別在長期多個化療周期后或大劑量化療之后，由于臨床使用的抗腫瘤藥物均有不同程度的毒副作用，即藥物治療在殺傷腫瘤細胞的同時，對正常的組織也有一定的損害，尤其常常出現(xiàn)不同程度的骨髓功能抑制，通常是先出現(xiàn)白細胞減少，然后出現(xiàn)血小板降低，部分患者甚至出現(xiàn)貧血癥狀，而骨髓抑制的出現(xiàn)使得治

2、療無法繼續(xù)進行，故導致治療失敗。嚴重的粒細胞、血小板減少可分別輸注粒細胞和血小板，嚴重的貧血可輸注紅細胞和營養(yǎng)促紅細胞生成素(EPO)。除此之外，目前常用的G-CSF，GM-CSF，促紅素以及IL-11。對輕微及中等程度的骨髓抑制情況有效果，但對于嚴重或長期慢性的骨髓抑制往往無效[1-4]。探索刺激廣譜造血功能恢復的治療方法，在臨床工作中非常需要。我們摸索了一種通過注射體外激活免疫細胞的細胞免疫治療方法，在放化療所致骨髓抑制的小鼠模型及

3、12例臨床病例取得良好的治療效果。 第一部分體外激活的免疫增強細胞對于放化療所導致骨髓抑制的恢復作用 (實驗研究) 目的：通過給予放化療導致的骨髓抑制小鼠注射體外激活的免疫細胞，比較不同注射時間、不同注射細胞數(shù)量對骨髓抑制的治療作用，觀察治療前后血細胞數(shù)、骨髓像、外周血干細胞勁員情況的變化以及激活免疫細胞分泌的細胞因子，研究分析其治療嚴重骨髓抑制的恢復作用的可能機制。方法：(1)根據(jù)預實驗結(jié)果給予小鼠腹腔內(nèi)注射1

4、.5mg卡鉑后立即給予250cGY的6MV直線加速器的全身照射建立骨髓抑制模型，按照不同的免疫細胞、不同注射時間及注射濃度分組，另設陰性處理組和空白對照組；(2)分離正常人外周血單個核細胞和正常BALB/c小鼠脾臟細胞，分別進行體外培養(yǎng)并激活；(3)觀察小鼠存活情況，比較不同注射時間之間、不同注射細胞數(shù)量之間、治療組與陰性對照組及空白對照組之間的存活率；觀察治療組治療前后血細胞數(shù)變化；檢測免疫細胞培養(yǎng)液中細胞因子情況；HE染色光鏡下觀察

5、治療前后骨髓像變化情況；流式細胞儀分析比較人免疫激活細胞與rhG-CSF對小鼠外周血干細胞動員情況。結(jié)果：(1)激活人白細胞預防組與處理組生存率分別為30％和90％，激活小鼠脾臟細胞預防組和處理組生存率分別為20％和100％。預防組與處理組比較P值分別為0.010和0.010，差異均顯著。(2)注射濃度為1×107細胞數(shù)的激活人白細胞注射組與陰性對照組、空白對照組的生存率分別為90％、20％和20％，注射濃度為1×107細胞數(shù)的激活小鼠

6、脾臟細胞注射組與陰性對照組、空白對照組的生存率分別為90％、10％和20％。三組之間比較P值分別為0.001和0.000，差異非常顯著。(3)不同濃度(分別注射1×105、1×106、1×107個細胞/只/次)的激活人白細胞處理組的生存率分別為80％、90％和100％；不同濃度(分別注射1×105、1×106、1×107個細胞/只/次)的激活小鼠脾臟細胞處理組的生存率分別為80％、90％和100％，各組之間比較P值分別為0.224和0.

7、760，統(tǒng)計學差異不顯著。(4)激活人白細胞處理組(1x107個細胞/次/只)與激活小鼠脾臟細胞處理組(1x107個細胞/次/只)間比較P值0.500，無顯著差異。(5)血細胞計數(shù)：處理后不同時間所計白細胞數(shù)、紅細胞數(shù)和血小板數(shù)經(jīng)重復測量方差分析檢驗，F(xiàn)值分別為55.577、56.593和96.517，P值均小于0.001，差異顯著。(6)細胞因子：檢測到的19個細胞因子當中，有7個(IL-1b，IL-2，IL-6，IL-8，G-CSF

8、，GM-CSF，MIP-1b)為較高分泌水平，9個(IL-4，IL-5，IL-10，IL-13，IL-17，IL-18，IFN-γ及MCP-1)為中等水平。而剩余3個(IL-7，IL-12andEotaxin)為非常低的分泌水平。(7)骨髓像檢查：在卡鉑及放射作用后2周，小鼠骨髓受到嚴重抑制，骨髓細胞破壞嚴重。骨髓像顯示“一片荒涼”。殘留的生發(fā)中心孤立分布。骨髓細胞數(shù)少于25％，大多數(shù)骨髓細胞為成熟的淋巴細胞及漿細胞。只有極少數(shù)細胞處于

9、分化成熟期。而治療開始后6周的骨髓像顯示骨髓血細胞明顯增多并且分布于細胞分裂的各個期。治療組細胞形態(tài)學分析也可發(fā)現(xiàn)骨髓中細胞數(shù)明顯增多，各系細胞都得到恢復。(8)外周血干細胞動員：通過檢測及記數(shù)外周血CD34+細胞，我門發(fā)現(xiàn)所采用的免疫治療對提升CD34+細胞具有持續(xù)性及可重復性，相對于使用G-CSF動員小鼠外周血CD34+細胞的效果更好。結(jié)論：通過注射經(jīng)過體外激活的免疫細胞能顯著增加骨髓抑制模型小鼠的存活率，用于治療骨髓抑制的療效滿意

10、。其可能的治療機制是：激活的免疫細胞分泌的多種細胞因子促進了骨髓各系造血過程的恢復。 第二部分體外激活的免疫增強細胞對于放化療所導致骨髓抑制的恢復作用 (臨床觀察)目的：在動物實驗研究的基礎(chǔ)上，探索在臨床工作中運用體外激活的免疫細胞治療長期接受放化療患者出現(xiàn)長期慢性骨髓抑制的療效。方法：(1)入組條件：該研究中的患者均為進展期的血液腫瘤或晚期已出現(xiàn)轉(zhuǎn)移病灶的惡性實體瘤患者。進入本治療前，入組患者均經(jīng)過高強度化療或長期的多

11、周期的化療，其中部分患者并接受過放射治療，入組患者處于嚴重的骨髓抑制狀態(tài)。并且接受過G-CSF，促紅細胞生成素，與IL-11的聯(lián)合治療至少2周而未能恢復。在這個開放性的非隨機性的臨床研究當中，總?cè)虢M患者為12人。(2)人外周血單個核細胞的獲取和培養(yǎng)：異基因的粒細胞來自健康供者，其ABO血型相匹配。利用Ficoll-Hypaque分離機采集分離外周血單個核細胞(PBMCs)。分離出的單個核細胞培養(yǎng)加入IL-2、GM-CSF以及鈣離子載體A

12、23187最大激活單核細胞及T細胞.(3)注射激活的免疫細胞：患者接受的激活免疫細胞數(shù)量為5x107細胞/日.于0，1，2三日回輸.3-7日休息恢復.這種每周治療3日，休息4日的周期重復4周.如果治療過程中血小板數(shù)達到40，000/mL時，治療亦可停止。在治療以外的時間對血中的血小板進行檢測，每周3次。當檢測到血小板數(shù)達到40，000/mL時，繼續(xù)監(jiān)測3次。在本研究過程當中入組患者不可以使用任何細胞因子以防對研究結(jié)果產(chǎn)生誤導。(4)數(shù)據(jù)

13、采集和分析：觀察細胞培養(yǎng)激活情況；取細胞培養(yǎng)激活后5天的培養(yǎng)上清進行細胞因子的檢測；對患者血小板和粒細胞進行計數(shù)以觀察其恢復情況；觀察治療過程中的不良反應。結(jié)果：(1)外周血單個核細胞生長情況：在2日的培養(yǎng)過程中，部分細胞生長情況良好。這些細胞在GM-CSF，IL-2，以及鈣離子載體的作用下不斷擴增。但同時也有對刺激物無反應的細胞最終死亡。我們觀察細胞膜的變化，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)前及培養(yǎng)后其變化不大。(2)血小板的恢復：10位長期嚴重的血小板減

14、少癥患者對該項治療有反應，治療后其血小板記數(shù)高于40，000/mL。其余2位患者對該治療無反應。在血小板計數(shù)得到改善的10位患者當中，2位接受過3次治療；3位接受過6次治療；3位接受過9次治療；還有2位接受過12次治療。(3)粒細胞恢復：實驗組患者中有6位同時表現(xiàn)為粒細胞低下。盡管曾接受過高強度的G-CSF治療，其粒細胞仍然底于正常。但經(jīng)過激活免疫細胞治療后，所有6位粒細胞低下患者其粒細胞記數(shù)均明顯提高并恢復至正常水平。本研究發(fā)現(xiàn)粒細胞

15、的恢復較血小板恢復要早。在嚴重的骨髓抑制患者粒細胞的恢復早于血小板恢復一至數(shù)周。入組治療患者當中有2例血小板未能像粒細胞一樣得到改善。初步觀察表明，相對于粒細胞而言，血小板的恢復需經(jīng)過更多次的治療及更長的治療時間。(4)細胞因子分析：檢測到的主要細胞因子為IL-1b，IL-2，IL-6，IL-8，G-CSF，GM-CSF，MIP-1b，IL-4，IL-5，IL-10，IL-13，IL-17，IL-18，IFN-gamma，及MCP-1等