真菌感染小鼠角膜過程中菌絲和主要炎癥細胞動態(tài)變化的研究.pdf

1、目的：
　　 由于真菌性角膜炎的具體發(fā)病機制尚不清楚，盡管不斷更新的實驗室診斷方法和大量真菌性角膜炎藥敏實驗的資料為臨床提供了相關(guān)信息，但真菌性角膜炎的臨床治療仍然靠最常見的經(jīng)驗進行，以致較多的患者最終喪失視力，甚至眼球的摘除。真菌性角膜炎現(xiàn)已成為治療效果差、致盲率高的眼科常見病。為此，本實驗建立一種模擬臨床上絲狀真菌感染人角膜模式的C57BL/6純系小鼠真菌性角膜炎模型，裂隙燈觀察真菌感染角膜后角膜組織損傷的臨床表現(xiàn)，常規(guī)石蠟

2、切片觀察角膜組織的病理形態(tài)學(xué)改變，角膜活體共焦顯微鏡動態(tài)觀察真菌性角膜炎動物模型影像學(xué)上的組織病理學(xué)變化，激光共聚焦掃描顯微鏡對真菌感染小鼠角膜過程中菌絲和主要炎癥細胞的動態(tài)變化進行研究，進而推動真菌性角膜炎發(fā)病機制研究的步伐，為臨床上更加積極有效地防治真菌性角膜炎提供理論和實驗基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1、動物模型建立
　　 選擇國內(nèi)最常見的致病菌種腐皮鐮刀菌和黃曲霉菌，采用C57BL/6純系小鼠右眼行真菌接

3、種，左眼為手術(shù)對照組。常規(guī)消毒后眼科手術(shù)顯微鏡下行角膜劃痕法接種真菌，深度為破壞角膜上皮到達淺基質(zhì)層，對照眼同樣方式劃痕接種生理鹽水。裂隙燈顯微鏡下觀察角膜感染情況并拍照記錄，分別于接種后第1，3，5，7，14d各時相對角膜組織病變進行臨床評分，同時行模型眼和對照眼角膜刮片后涂片染色和真菌培養(yǎng)，并對各種病原學(xué)檢測結(jié)果進行對比分析。
　　 2、組織病理學(xué)檢測
　　 分別于接種后第1，3，5，7，14d各時相摘取小鼠眼球，置

4、于福爾馬林固定24h，常規(guī)石蠟切片，行PAS染色，光學(xué)顯微鏡下對不同時間點角膜組織的破壞和菌絲的形態(tài)特點進行分析。
　　 3、活體角膜共焦顯微鏡研究
　　 真菌感染小鼠模型眼和對照眼角膜早期(造模后6h、8h、12h、1d)、中期(2d、3d、5d)、后期(7d、14d)，分別行角膜中央感染區(qū)及病灶周邊部的角膜共焦顯微鏡檢查，對病變角膜浸潤病灶的中心區(qū)及周邊區(qū)選擇5個位點進行三維掃描。分別于接種后第1，3d時間點，每組隨

5、機取12只小鼠常規(guī)角膜刮片后染色鏡檢和真菌培養(yǎng)。
　　 4、全角膜平鋪片的激光共聚焦掃描顯微鏡研究
　　 分別于接種后第12h，1，3，5，7d各時相眼球赤道穿透性切取帶角膜緣的整個眼前節(jié)，于新鮮配置的PBS液中剔除虹膜，置1％多聚甲醛—PBS中固定30min，0．2％Triton X—100的2％BSA液透膜15min；分別使用CFW熒光染料、標記中性粒細胞熒光抗體、標記淋巴細胞抗體于4℃避光孵育過夜，放射狀切開平鋪于

6、載玻片上，使用溶有DAPI染料的膠水固定過夜。在激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察真菌的生長方式以及對真菌進行定量分析，觀察真菌感染角膜過程中的炎癥細胞表達的變化。
　　 5、真菌性角膜炎臨床早期診斷的應(yīng)用研究
　　 臨床疑似真菌性角膜炎患者165例行角膜刮片，獲取的角膜刮取物用于角膜涂片鏡檢和真菌培養(yǎng)。同一病人一部分角膜刮取物均勻地涂在兩張已處理過的載玻片中央，其中一張角膜涂片先行KOH濕片，在光鏡下觀察后行CFW熒光染色；同

7、一病人的另外一張角膜涂片，先行Giemsa染液染色，光鏡下觀察后行CFW熒光染色。
　　 6、統(tǒng)計學(xué)處理
　　 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS13．0軟件包進行統(tǒng)計學(xué)處理，分別采用Kraskal—willis H檢驗、單因素LSD t檢驗、Mann—Whitney U檢驗、卡方(chi—square test)檢驗、趨勢卡方檢驗等統(tǒng)計學(xué)方法分析，P<0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、模型眼角膜刮

8、片染色與真菌培養(yǎng)
　　 兩種真菌性角膜炎病變過程的早期(1d)，中期(3d)CFW熒光染色的陽性率顯著高于KOH濕片和Giemsa染色的陽性率，差異有統(tǒng)計學(xué)差異(鐮刀組1dCFWvs KOH，P=0．047；1dCFW vs Giemsa，P=0．047；3d CFW vs KOH，P=0．007;3dCFW vs Giemsa，P=0．001；黃曲組1dCFW vs KOH，P=0．047；1dCFW Vs Giemsa，P=

9、0．007；3d CFW vs KOH，P=0．047；3dCFW vs Giemsa，P=0．001)，但與真菌培養(yǎng)的陽性率相比，無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0．05)。在病變的后期，各種檢查方法很少能探測到真菌的存在。
　　 2、真菌感染角膜病變特征
　　 兩種真菌感染角膜后病變的發(fā)展過程具有一定差異，在2—5d是病變的高峰期，7d后病變逐步減輕。兩種真菌感染角膜后病程約2w，腐皮鐮刀菌組病變過程相對較平穩(wěn)，黃曲霉菌組病變發(fā)展

10、快且嚴重。黃曲模型眼在1，3，5，7，14d時間點病變的臨床評分組內(nèi)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0．05)，黃曲霉菌角膜炎第3天及第4天臨床評分明顯高于腐皮鐮刀菌角膜炎，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0．05)。
　　 3、角膜組織病理學(xué)檢查
　　 接種后第1 d可見劃痕處角膜上皮層部分或完全缺損，缺損面細胞水腫嚴重，呈水泡樣變，基質(zhì)水腫，兩種真菌菌絲主要分布于淺、中基質(zhì)層；第3d可見上皮缺損面積縮小，角膜基質(zhì)水腫嚴重，基質(zhì)層膠

11、原纖維排列紊亂，菌絲分布于角膜全層，鐮刀菌絲體較粗長，曲霉菌絲體短小，部分病變角膜在未穿孔前已有菌絲或孢子穿透角膜內(nèi)皮進入前房；第5天可見部分小鼠角膜上皮層局限性增生修復(fù)，部分仍可見潰瘍灶，基質(zhì)嚴重水腫，偶見菌絲生長，菌絲量明顯少于第3天，并見菌絲體縮小，新生血管長入。接種后第7天，角膜全層未見菌絲，較多新生血管長入角膜基質(zhì)。
　　 4、角膜共焦顯微鏡診斷的敏感性
　　 兩種真菌性角膜炎動物模型在造模后的第1，3d時間點

12、，以真菌培養(yǎng)為標準，共焦顯微鏡診斷的陽性率與CFW熒光染色的陽性率相比較，無明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(P>0．05)；在第5d時間點，真菌菌絲的檢出率較低；第7d后真菌菌絲檢出率為0。
　　 5、菌絲的影像學(xué)特征
　　 激光共焦顯微鏡圖像顯示：在感染早期，腐皮鐮刀菌表現(xiàn)為短線狀或蚯蚓狀結(jié)構(gòu)，中期為長而支挺、分支極少的長線狀結(jié)構(gòu)，病變部位角膜形態(tài)結(jié)構(gòu)破壞明顯；黃曲霉菌在早期為短小、彎曲的蠕蟲狀結(jié)構(gòu)，中期為走行更加彎曲，分支較多呈樹

13、枝狀或簇狀結(jié)構(gòu)，病變部位角膜形態(tài)結(jié)構(gòu)消失。后期均未真菌結(jié)構(gòu)。
　　 6、菌絲在模型眼角膜中的動態(tài)變化
　　 鐮刀菌首先在病變部位粘附，然后生長繁殖，真菌感染后12h，真菌侵入的層次局限為淺、中基質(zhì)層，在1d時，真菌已分布角膜全層。在接種點周圍，菌絲在淺、中、深基質(zhì)生長方式有明顯的層次性。真菌的菌絲量在3d達到峰值。5d后突然減少消失。黃曲霉菌在病變部位粘附的時間相對較晚，但其生長繁殖速度較快，真菌感染后12h，真菌侵入的

14、層次已有菌絲在深基質(zhì)層，在1d時，真菌已分布角膜全層，其生長方式絲縱橫交錯，交織成網(wǎng)。真菌的菌絲量在2d達到峰值。在3d時，真菌的菌絲已有所減少，5d后真菌菌絲較少或已消失。黃曲霉菌第1天及第2天菌絲的含量明顯高于鐮刀菌，但在第3天低于鐮刀菌，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(1d，t=—8．657，p=0．000；2d，t=—16．952，p=0．000；3d，t=4．543，p=0．000)，在12h與5d時間點，兩組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0

15、．05)。
　　 7、模型眼角膜組織中性粒細胞表達的變化
　　 正常小鼠角膜鞏膜緣區(qū)域有少量中性粒細胞的散在分布。模型對照組鼠眼術(shù)后12h角膜上9個區(qū)域里中性粒細胞的數(shù)量達到峰值，隨后中性粒細胞的數(shù)量逐漸減少。兩種真菌性角膜炎模型眼12h角膜上各個區(qū)域里中性粒細胞的數(shù)量都達到第一個峰值，3d時角膜里中性粒細胞的數(shù)量達到了第二個峰值，5d后中性粒細胞數(shù)量逐步減少(圖3—22，3—23)。兩組模型眼組內(nèi)不同時間點中性粒細胞的

16、數(shù)量相比有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(鐮刀組F=311．858，p=0．000；黃曲組F=570．811，p=0．000)。在12h，1d，3d，7d時間點兩組中性粒細胞的數(shù)量相比有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(12h，t=—3．519，p=0．006；1d，t=—4．659，p=0．001；3d，t=—5．338，p=0．000；7d，t=4．335，p=0．001)。
　　 8、模型眼角膜組織淋巴細胞表達的變化
　　 正常小鼠角膜鞏膜緣區(qū)域

17、有少量淋巴細胞的散在分布。模型對照組鼠眼術(shù)后12h角膜上淋巴細胞的數(shù)量開始增多，24h淋巴細胞的數(shù)量到達峰值，隨后逐漸減少。鐮刀菌模型5d眼角膜里淋巴細胞的數(shù)量達到峰值，隨后其數(shù)量逐步減少。在病程的中期和后期，黃曲霉菌模型眼角膜里淋巴細胞的數(shù)量與鐮刀菌淋巴細胞數(shù)量相比，有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(3d，t=—10．217，p=0．000；5d，t=—22．704，p=0．000；7d，t=—7．444，p=0．000)。
　　 9、臨床

18、角膜刮片染色與真菌培養(yǎng)
　　 以真菌培養(yǎng)陽性作為診斷真菌性角膜的金標準，在同一張角膜涂片KOH和CFW染色的敏感性分別為81．0％和96．6％，在同一張角膜涂片Giemsa和CFW染色的敏感性為39．7％和98．3％，此外，Giemsa檢測到23例細菌感染，其中6例為混合感染。CFW染色的敏感性顯著高于KOH和Giemsa染色。
　　 結(jié)論：
　　 1、我們在宿主正常免疫狀態(tài)下，采用角膜劃痕法成功建立了模擬臨床真

19、菌性角膜炎自然感染過程的動物模型。為推動真菌性角膜炎的基礎(chǔ)和臨床應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 2、真菌感染角膜的病變過程歷經(jīng)發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸三個階段，即早、中、晚三期。不同菌種感染角膜的病變嚴重程度各有差異，中期是決定真菌性角膜炎預(yù)后的關(guān)鍵時間窗。
　　 3、CFW熒光染色簡單、快捷、敏感性高、特異性強?；铙w角膜共焦顯微鏡能夠?qū)崟r動態(tài)監(jiān)控真菌的變化，且敏感性高、特異性強。兩者均是實驗室判定真菌性角膜炎動物模型的好方法。

20、r>　　 4、不同菌種感染所致真菌性角膜炎激光共焦顯微鏡下菌絲有不同的影像學(xué)特點，且同一菌種不同時期在角膜組織中菌絲形態(tài)也有較大差異。為角膜共焦顯微鏡用于真菌性角膜炎的基礎(chǔ)研究奠定了堅實基礎(chǔ)，為臨床上真菌性角膜炎的共焦顯微鏡鑒別診斷提供影像學(xué)資料。
　　 5、應(yīng)用激光共聚焦掃描顯微鏡能夠?qū)θ悄ふ婢畔蚀_的定性定量觀察。黃曲霉菌菌絲較細，多密集分布，生長繁殖較快，生長方式雜亂無章。鐮刀菌菌絲較粗，生長繁殖相對較慢，其生長方式

21、有明顯的層次性。
　　 6、應(yīng)用激光共聚焦掃描顯微鏡能夠?qū)θ悄ぱ装Y細胞的信息進行準確定性定量觀察。早期和中前期浸潤、募集的中性粒細胞對真菌的裂解、吞噬起主要作用，中后期浸潤、募集的中性粒細胞對角膜組織則主要起到破壞作用。淋巴細胞的浸潤募集較中性粒細胞出現(xiàn)晚，其峰值出現(xiàn)在中后期，因此，淋巴細胞在后期角膜病變中也起到重要作用。
　　 7、Gicmsa與CFW聯(lián)合染色是臨床診斷疑似真菌性角膜炎的較理想的方法，該聯(lián)合染色不但靈