牛泡沫病毒BTas蛋白TRE序列精細(xì)界定及其DNA結(jié)合域分析.pdf

1、牛泡沫病毒(Bovine Foamy Virus,BFV)是反轉(zhuǎn)錄病毒科泡沫病毒亞科泡沫病毒屬的成員,該病毒具有復(fù)雜的基因組結(jié)構(gòu)和獨特的基因表達(dá)調(diào)節(jié)過程與傳統(tǒng)的反轉(zhuǎn)錄病毒區(qū)別較大。它的基因轉(zhuǎn)錄受到兩個啟動子的調(diào)節(jié),其中位于5’端的LTR負(fù)責(zé)結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄,位于env基因內(nèi)部的啟動子IP則調(diào)節(jié)BTas等非結(jié)構(gòu)蛋白的合成,并且這兩個啟動子的活性都可被BTas蛋白激活。目前已經(jīng)清楚,LTR和IP中的Tas應(yīng)答元件(TRE)為病毒復(fù)制所必需,并

2、且BTas可以結(jié)合于LTR上的TRE片段,本文即進(jìn)一步在BTas與TRE的具體作用機制方面進(jìn)行了一些研究。 利用本室分離的牛泡沫病毒BFV3026中國毒株為材料,主要進(jìn)行了如下幾個方面的工作：(1)通過構(gòu)建BTas蛋白一系列缺失體的原核表達(dá)質(zhì)粒,對若干BTas缺失蛋白進(jìn)行表達(dá)純化。利用純化的缺失蛋白以及制備TRE片段作為探針進(jìn)行體外結(jié)合實驗,通過凝膠阻滯分析BTas的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域；(2)對已知TRE序列進(jìn)行截短實驗,以期將T

3、RE區(qū)域進(jìn)一步界定,從而確定與BTas結(jié)合的最小區(qū)域；(3)在將TRE縮短之后,進(jìn)行激活功能研究：一方面通過缺失截短后的TRE片段以分析其在BTas激活過程中的作用,另一方面構(gòu)建僅含應(yīng)答元件的質(zhì)粒,以檢測該片段能否獨立應(yīng)答B(yǎng)Tas的激活。 BTas應(yīng)答元件分為TREI和TREII,本文選擇TREII通過缺失實驗對其精細(xì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行凝膠阻滯分析,發(fā)現(xiàn)了一段22bp的堿基序列為BTas最小結(jié)合區(qū),命名為Minimal TRE Domai

4、n, MTD。序列比對發(fā)現(xiàn),在TREII序列內(nèi)至少存在4個MTD。MTD突變序列分析證明,BTas與MTD的結(jié)合是直接的和特異性的,即BTas只能與特定的DNA序列識別并結(jié)合。利用Luc報告基因驗證了,在第四個MTD缺失的情況下BTas的激活作用受到了顯著的抑制；在串聯(lián)2個MTD存在的情況下BTas可以行使激活功能,第四段MTD對于應(yīng)答B(yǎng)Tas的激活有著最為重要的作用。對BTas蛋白進(jìn)行了DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的劃分,證實了BTas的N端為D