口蹄疫病毒感染細(xì)胞中PI4KB招募以及3A-3Dpol-PI4KB復(fù)制復(fù)合物的形成.pdf

1、微RNA病毒(Picornavirus)感染細(xì)胞后，破壞細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的雙向運(yùn)輸，細(xì)胞內(nèi)膜被重構(gòu)成以磷脂酰肌醇-4-磷酸（Phosphatidylinositol-4-phosphate，PI4P）為主的膜環(huán)境。在重構(gòu)的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)上，病毒通過其非結(jié)構(gòu)蛋白招募特定細(xì)胞蛋白在細(xì)胞內(nèi)膜上形成病毒復(fù)制復(fù)合物，這是微RNA病毒有效復(fù)制的基礎(chǔ)。PI4P是由磷脂酰肌醇-4-激酶Ⅲβ亞基(Phosphatidylinositol-4-kinaseⅢβ，PI

2、4KB)催化生成，因此，病毒蛋白招募PI4KB到達(dá)復(fù)制位點(diǎn)對病毒的復(fù)制至關(guān)重要。微RNA病毒招募PI4KB的分子機(jī)制，是近幾年病毒學(xué)研究的熱點(diǎn)。微RNA病毒的RNA依賴性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp，又稱3Dpol）的生物學(xué)功能是復(fù)制病毒的RNA，因此，3Dpol是病毒復(fù)制復(fù)合物的核心。研究復(fù)制復(fù)合物的形成是了解病毒在感染細(xì)胞中復(fù)制過程的重要方面。
　　口蹄疫(Foot-and-

3、mouth disease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)引起的傳染病，給牛羊豬等偶蹄動物養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。FMDV是一種微RNA病毒，其顯著特點(diǎn)是復(fù)制速度快和宿主嗜性范圍廣，這可能與病毒獨(dú)特的復(fù)制特性有關(guān)。本研究旨在探討FMDV在感染細(xì)胞中招募PI4KB的機(jī)制以及病毒復(fù)制復(fù)合物的形成。
　　在IBRS-2細(xì)胞中，特異性沉默內(nèi)源性PI4KB的表達(dá)，可抑制FMDV

4、非結(jié)構(gòu)蛋白3A的表達(dá)、降低病毒復(fù)制的滴度以及抑制病毒基因組的復(fù)制;相反，PI4KB的過表達(dá)可促進(jìn)3A的表達(dá)、提升病毒的滴度以及提高病毒基因組的復(fù)制。這些結(jié)果表明，PI4KB是FMDV復(fù)制所必需的細(xì)胞蛋白。Co-IP和GST pulldown實(shí)驗證實(shí)，F(xiàn)MDV3A與PI4KB存在間接的相互作用;在FMDV感染細(xì)胞中，3A與內(nèi)源性PI4KB共定位于復(fù)制位點(diǎn)，表明FMDV3A間接招募PI4KB到達(dá)病毒復(fù)制位點(diǎn)，暗示存在其它蛋白介導(dǎo)3A招募PI

5、4KB。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MDV3A和PI4KB都直接相互作用于細(xì)胞蛋白?；o酶A含3結(jié)合域(Acyl-Co-A Binding Domain containing3，ACBD3)的羧基端GOLD結(jié)構(gòu)域;GST pulldown競爭實(shí)驗證實(shí)，3A與ACBD3結(jié)合的親和性高于ACBD3與PI4KB的結(jié)合，這些結(jié)果表明3A競爭性結(jié)合ACBD3-PI4KB中的ACBD3，暗示ACBD3介導(dǎo)3A招募PI4KB。然而，沉默IBRS-2細(xì)胞內(nèi)AC

6、BD3的表達(dá)并不損害FMDV3A與PI4KB的共定位以及FMDV的復(fù)制，說明ACBD3對于3A招募PI4KB是非必需的。這些結(jié)果提示，存在未知的蛋白介導(dǎo)FMDV3A招募PI4KB到達(dá)病毒的復(fù)制位點(diǎn)。在篩選與FMDV3Dpol相互作用的細(xì)胞蛋白過程中，PI4KB被鑒定為與3Dpol相互作用的候選蛋白。Co-IP和GST pulldown證實(shí)FMDV3Dpol與PI4KB存在直接相互作用;在FMDV感染細(xì)胞過程中，3Dpol與內(nèi)源性PI4K

7、B共定位于病毒的復(fù)制位點(diǎn);另外，F(xiàn)MDV3Dpol與3A之間也存在相互作用。這些結(jié)果表明，在FMDV復(fù)制位點(diǎn)可形成至少包含3A、3Dpol和PI4KB的復(fù)制復(fù)合物，此復(fù)合物的形成是FMDV有效復(fù)制的前提。
　　概括起來，本研究有三個貢獻(xiàn)點(diǎn):FMDV3A招募PI4KB到達(dá)病毒復(fù)制位點(diǎn)，后者是病毒復(fù)制所必需的;盡管3A競爭性結(jié)合ACBD3-PI4KB中的ACBD3，但是ACBD3對于3A招募PI4KB是非必需的;在FMDV感染細(xì)胞中3