版權說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內容提供方,若內容存在侵權,請進行舉報或認領
文檔簡介
1、[研究背景及目的]
多囊腎病(PKD)是一組常見的遺傳性腎病,其主要病理改變是雙側腎臟的各個節(jié)段形成進行性擴張的液性囊泡,壓迫周圍的正常腎組織,導致腎功能衰竭,而嚴重影響患者的生活與生存。根據(jù)遺傳方式的差異,多囊腎病主要分為常染色體顯性多囊腎病(ADPKD)及常染色體隱性多囊腎病(ARPKD)。雖然研究已發(fā)現(xiàn)越來越多的PKD相關致病基因和可能的發(fā)病機制,但至今尚無有效的治療手段,臨床上普遍采取的僅是對癥處理。依據(jù)發(fā)病機制轉化臨
2、床治療策略已經成為迫切需求。
研究表明基因突變而導致纖毛結構或者功能的缺陷會出現(xiàn)類似多囊腎病的表型,而“纖毛致病假說”也為近年來PKD的研究熱點之一。假說認為多種ADPKD和ARPKD致病基因編碼的蛋白質分布于腎管上皮細胞的初級纖毛上,可能參與感受管腔內的液流機械刺激以及纖毛相關蛋白的運輸。
Hippo通路在果蠅及哺乳動物上皮細胞中均高度保守,是調控器官組織大小的重要信號通路,通路異常與多種腫瘤的發(fā)生密切相關。
3、> 近年來研究提示Hippo通路異常,特別是其靶因子Yap表達水平及活性的改變,與腎臟異常發(fā)育及多囊腎病的發(fā)生密切相關。本科室前期研究亦表明,在雜合型Han∶ SPRD大鼠和ADPKD患者腎組織中存在YAP異常高表達及核轉位。
然而Yap在正常生理狀態(tài)下,是否以及如何參與腎臟發(fā)育,及對多囊腎病發(fā)生和進展的影響機制尚有待于探索。因此,以模式生物斑馬魚為模型,通過morpholino顯微注射技術下調yap表達,觀察到其對斑馬魚前
4、腎囊腫形成,腎管發(fā)育形態(tài),群體細胞遷移,纖毛發(fā)生的重要作用,并發(fā)現(xiàn)在多囊腎斑馬魚模型pkd2morphants(morpholino注射胚胎)過表達可磷酸化的Yap蛋白能夠顯著降低前腎囊腫比例。本研究首次闡述了Yap在體內與纖毛發(fā)生及囊腫形成的相關性,以及抑制多囊腎病進展的保護性作用,為多囊腎病治療提供了新的靶點和契機。
[實驗方法]
一、檢測斑馬魚胚胎發(fā)育中的yap基因表達譜和蛋白細胞亞定位
應用prim
5、er premier5.0軟件,設計針對斑馬魚Yap基因的上下游引物并合成,通過基因克隆技術構建pCS2-yap,pTol2-8kb-EG FP-yap質粒,T7轉錄獲得yap反義mRNA探針。收集不同發(fā)育階段的斑馬魚胚胎,通過原位雜交技術,觀察yap mRNA在不同發(fā)育時期的表達譜,重點關注其在腎管及纖毛相關的器官的分布。
收集受精后1天(1 d.p.f)和2天斑馬魚胚胎,Dents液(80%甲醇∶20%二甲基亞砜)固定后,
6、進行免疫熒光染色,檢測內源性Yap蛋白的細胞亞定位;在一細胞期斑馬魚胚胎細胞內注射pTol2-8kb-EGFP-yap質粒和轉座酶mRNA,收集在腎管有特異性綠色熒光的轉基因胚胎,檢測外源性Yap蛋白的細胞亞定位。
二、斑馬魚胚胎反義嗎啉環(huán)寡核苷酸(MO)顯微注射下調Yap表達
MO技術目前已廣泛運用于生物發(fā)育中基因功能研究。其序列通過堿基互補能與特定的mRNA結合形成雙鏈物有效阻止mRNA的成熟或蛋白質翻譯。本研究
7、根據(jù)已有文獻報道,合成獲得特異性結合斑馬魚yap5'端非翻譯區(qū)(UTR)的MO序列,注射到一細胞期斑馬魚胚胎卵黃中獲得下調Yap表達,并通過免疫印跡(western blotting)檢測Yap蛋白表達變化,及表型回復實驗明確MO的有效性和特異性。
三、觀察yap對斑馬魚腎管發(fā)育,細胞遷移,細胞極性,纖毛生成的影響
觀察yap morphant不同胚胎發(fā)育時期大體表型改變;通過轉基因魚Tg(Na+/K+ATPase∶
8、EGFP)觀察yap morphant前腎發(fā)育的改變;原位雜交檢測yap morphant前腎腎管不同節(jié)段標記探針的表達差異,了解腎管群體細胞遷移的改變;免疫熒光檢測yap morphant腎管頂?shù)锥思毎麡O性的改變;免疫熒光檢測yap morphant纖毛形態(tài)的變化,以及在纖毛發(fā)生過過程中基體向頂端膜遷移過程的改變;顯微共注射觀察Yap與纖毛相關基因促進斑馬魚前腎囊腫形成的協(xié)同效應。
四、觀察斑馬魚中Yap與多囊蛋白2(pol
9、ycystin-2,PC-2)之間的相互關系
通過顯微共注射觀察在斑馬魚胚胎發(fā)育中yap與ADPKD致病基因pkd2在前腎囊腫形成過程中存在基因互作效應;而在pkd2 morphants中過表達全長yapmRNA和磷酸化位點突變的yapS127A mRNA,觀察對前腎囊腫形成比例的影響。
五、統(tǒng)計學處理
所有結果以(x)±s表示,數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism5.0軟件進行統(tǒng)計學分析及制圖。方差齊性采
10、用非配對t檢驗,方差非齊性則采用秩和檢驗。多組間分析采用one way ANOVA。P<0.05為組間差異有統(tǒng)計學意義。
[實驗結果]
一.yap在斑馬魚胚胎發(fā)育中的表達定位研究
原位雜交顯示,在斑馬魚胚胎發(fā)育中yap是母源表達基因,合子基因表達從中囊胚過度時期(MBT)開始,在最早于6體節(jié)期(S)可見于側板中胚層(LPM)和中間中胚層(IM)分布,而后在19s,24 hpf,48 hpf,72 hpf均在
11、前腎腎管中有表達,此外在纖毛相關器官眼,耳,腦中也有分布。
運用Yap抗體進行免疫熒光顯示內源性Yap蛋白明顯分布于斑馬魚腎管,其細胞亞定位為在腎管上皮細胞頂端膜及胞漿聚積;而在腎管特異性過表達EGFP-Yap融合蛋白,顯示的細胞亞定位與內源性蛋白免疫熒光結果一致。
二.yap對斑馬魚腎管發(fā)育,細胞遷移,細胞極性的影響
ap morphants在胚胎發(fā)育過程中出現(xiàn)心包水腫,腦水腫,前腎囊腫,體軸輕微彎曲,小
12、眼,短體等表型,且這些表型能夠通過過表達全長的yap mRNA獲得一定程度的回復,前腎囊腫比例顯著下降,而過表達磷酸化位點突變的yapS127A mRNA,前腎囊腫比例改變沒有統(tǒng)計學意義;轉基因斑馬魚Tg(Na+/K+ATPase∶EGFP)可觀察腎管發(fā)育各階段的變化,發(fā)現(xiàn)yap morphants在24 hpf腎管泄殖腔可見閉合異常及膨大擴張,其比例約15%,從48 hpf開始可見6.7%的腎管出現(xiàn)中斷,其比例隨時間推移明顯增加,至7
13、2 hpf可達到26%,分別通過cldh17探針原位雜交和α-6F抗體免疫熒光觀測72 hpf胚胎前腎腎管全長,均可見同轉基因魚顯示的腎管中斷現(xiàn)象,而泄殖腔形態(tài)異常的比例隨胚胎發(fā)育沒有明顯改變,此外腎管總體長度變短,前端的彎曲消失,提示腎管群體細胞遷移異常;24 hpf胚胎PCNA抗體免疫熒光顯示腎管遠端細胞增殖無明顯異常;分別通過斑馬魚前腎腎管節(jié)段特異性的標記探針進行原位雜交,可見在24 hpf胚胎wt1b,slc4a4a,trpm-
14、7,slc12a1,slc12a3,evx1的表達均沒有明顯改變,說明細胞命運并沒有改變;而觀測72 hpf胚胎,可見wt1b標記的腎小球形成囊腫樣擴張,slc4a4a標記的腎管前端“發(fā)夾”樣彎曲消失,遷移明顯滯后,且在slc4a4a+,trpm-7+和slc12a1+細胞節(jié)段可見腎管中斷,泄殖腔標記探針evx1表達下調甚至消失;免疫熒光顯示yap morphants頂?shù)锥四ぜ毎麡O性存在異常,頂端膜標記蛋白aPKC分布無明顯異常,而側基
15、底膜標記蛋白α-6F在基底膜分布減少,并在頂端膜也存在定位。
三.yap對斑馬魚纖毛形成的影響
yap morphants存在多種類“纖毛病”表型,而眼及腎管的纖毛形態(tài)存在缺陷:眼部外層纖毛明顯變短甚至缺失;腎管中段多纖毛區(qū)明顯變少,或被單纖毛取代,而后段單纖毛數(shù)量(20.3±1.5 vs對照組30.3±2.7; n=175,P<0.01)和長度(3.9±0.2μm vs對照組6.2±0.2μm; n=175,P<0
16、.001)顯著變短;腎管多纖毛基體非正常的線性排列,而變?yōu)閳F狀簇擁,這可能是影響多纖毛束形成;部分多纖毛和單纖毛基體在擴張的腎管中亦未完全遷移至頂端膜,影響纖毛的發(fā)生。原位雜交檢測纖毛主宰基因foxj1a,發(fā)現(xiàn)在24 hpf和72 hpf的yap morphants胚胎表達均上調,因在野生型及yap morphants中過表達foxj1a mRNA并未對纖毛結構有明顯影響,考慮yap morphants胚胎中foxj1a表達是反饋性上調
17、。而檢測多纖毛標記探針shippo1發(fā)現(xiàn)在72 hpfyap morphants胚胎存在分布的異常。此外,顯微共注射實驗證實斑馬魚中yap分別與纖毛蛋白運輸相關基因ift20,ift88和arl13b在前腎囊腫形成的通路上存在協(xié)同互作效應。
四.Yap與多囊蛋白2(PC-2)的基因互作效應,以及過表達可磷酸化Yap蛋白對pkd2 morphants前腎囊腫生成的保護性作用
在斑馬魚胚胎發(fā)育中yap與ADPKD致病基因
18、pkd2在前腎囊腫形成過程中存在基因互作效應,在低濃度yap MO和pkd2 MO共注射胚胎產生前腎囊腫的比例遠大于單獨MO注射胚胎,差異具有顯著統(tǒng)計學差異。在pkd2 morphants中過表達全長yap mRNA能夠顯著降低其前腎囊腫形成的比例,但是在pkd2 morphants中過表達磷酸化位點突變的yapS127A mRNA沒有表型回復效果。
[結論]
1.在斑馬魚胚胎發(fā)育中yap mRNA在前腎腎管中有持續(xù)
19、表達,而Yap蛋白在腎管上皮細胞頂端膜及胞漿聚積。
2.在斑馬魚胚胎下調ap表達會出現(xiàn)心包水腫,腦水腫,前腎囊腫,體軸輕微彎曲,小眼,短體等類似“纖毛病”的表型。
3.yap morphants前腎腎管各個節(jié)段的細胞群體遷移存在缺陷。
4.yap morphants前腎腎管的側基底膜細胞極性存在異常,向頂端膜分布。
5.yap morphants眼及腎管的纖毛形態(tài)存在缺陷,腎管多纖毛基體的排列和單
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網頁內容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
- 4. 未經權益所有人同意不得將文件中的內容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內容負責。
- 6. 下載文件中如有侵權或不適當內容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 腎囊腫手術及護理
- 腎囊腫ppt課件
- 腎囊腫去頂術
- 腎囊腫假性強化的實驗及臨床研究.pdf
- 腹腔鏡腎囊腫去頂術與經皮腎囊腫穿刺.pdf
- 雙腎囊腫全面解析
- 腹腔鏡腎囊腫
- 腎囊腫去頂術護理
- 單純性腎囊腫概述
- 經皮腎囊腫去頂術
- 單純性腎囊腫患者腎功能影響因素的研究.pdf
- 腹腔鏡治療腎囊腫的臨床研究.pdf
- 特殊類型腎囊腫性疾病的臨床分析.pdf
- 腹腔鏡下腎囊腫去講訴
- 稀土對斑馬魚胚胎發(fā)育的影響.pdf
- 斑馬魚胰腺形態(tài)學觀察及siPDX-1對斑馬魚胰島發(fā)育的影響.pdf
- 單純性腎囊腫分型及其意義的研究.pdf
- 主動脈夾層與腎囊腫的相關性研究.pdf
- 雙側單純性腎囊腫患者的護理查房
- 單純性腎囊腫與高血壓病的關系.pdf
評論
0/150
提交評論