食管鱗癌相關(guān)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鲷邔?shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:食管鱗癌與其它腫瘤一樣，是一種復(fù)雜疾病。復(fù)雜性系統(tǒng)理論逐漸應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究，特別是復(fù)雜疾病諸如腫瘤的探究。蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)是最常研究的生物分子網(wǎng)絡(luò)，近年來模式生物研究表明，網(wǎng)絡(luò)中Hub蛋白（高度連接的節(jié)點(diǎn)）具有重要生物學(xué)功能，在人類疾病網(wǎng)絡(luò)中，腫瘤蛋白傾向成為Hub節(jié)點(diǎn)。本研究的目的:1）構(gòu)建食管鱗癌相關(guān)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)并分析其拓?fù)鋵W(xué)特征。2）探討Hub基因在食管鱗癌組織和遠(yuǎn)端正常組織中mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)狀況。3）探討

2、兩個(gè)表觀遺傳抑制劑5-aza-DC、TSA以及Lrig1過表達(dá)對(duì)食管癌細(xì)胞ECA109細(xì)胞株Hub基因mRNA表達(dá)的影響。
　　方法:1）首先，從PubMed數(shù)據(jù)庫和中文數(shù)據(jù)庫，應(yīng)用PolySearch文獻(xiàn)挖掘軟件，確認(rèn)食管鱗癌相關(guān)基因/蛋白，并將這些基因分成兩組，一組來自Pubmed數(shù)據(jù)庫，不受民族地域限制，另一組來自中文數(shù)據(jù)庫，僅限與新疆哈薩克族食管鱗癌相關(guān)。然后，應(yīng)用復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分析軟件Pajek和Cytoscape軟件，以“度

3、”和“介數(shù)”這兩個(gè)指標(biāo)，構(gòu)建五個(gè)級(jí)別的食管鱗癌相關(guān)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。最后，分析這些網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵W(xué)特征和生物學(xué)特征之間的關(guān)系。2）分別從48例漢族和40例哈薩克族食管鱗癌組織及配對(duì)的正常組織提取mRNA，應(yīng)用半定量RT-PCR，對(duì)Hub基因進(jìn)行mRNA水平的檢測(cè)，并分析這些基因在癌組織和無癌組織中的陽性表達(dá)率、表達(dá)量的差異以及與患者的臨床病例關(guān)系。最后，運(yùn)用免疫組化技術(shù)，在33例哈薩克族食管鱗癌組織及配對(duì)的正常組織切片確認(rèn)幾個(gè)基因蛋白表達(dá)

4、狀況。3）采用DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-DC及組蛋白去乙?；敢种苿┲泼咕谹(TSA)作用于食管癌ECA109細(xì)胞，并檢測(cè)目的基因表達(dá)狀況。過表達(dá)食管癌ECA109細(xì)胞Lrig1，然后檢測(cè)目的基因在過表達(dá)組和對(duì)照組表達(dá)差異。
　　結(jié)果:1）在核心網(wǎng)絡(luò)CNCA中，最大子網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)數(shù)為214個(gè)，子網(wǎng)個(gè)數(shù)為83個(gè)，與100個(gè)隨機(jī)網(wǎng)絡(luò)相比均具差異。擴(kuò)展網(wǎng)絡(luò)中蛋白與KEGG數(shù)據(jù)庫27條生物學(xué)途徑相關(guān)，最相關(guān)的路徑為“Paths_

5、in_cancer”。根據(jù)兩組五個(gè)級(jí)別的骨干網(wǎng)絡(luò)分析，節(jié)點(diǎn)介數(shù)越高成為“Paths_in_cancer”成員的概率越高、互為對(duì)方相關(guān)基因的概率越高。兩組初始基因衍生出來的類似網(wǎng)絡(luò)相應(yīng)重疊率比兩組初始基因的重疊率更高。2)在漢族組和哈族組大部分基因mRNA表達(dá)率均高于50％，漢族組，癌組織與正常組織中表達(dá)率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的基因有3個(gè)，分別是AR、EGFR、SPP1;哈族組具有差異兩個(gè):AR和EGFR。漢族組表達(dá)上調(diào)的基因11個(gè):EP300、

6、VIM、KDM5B、MDM2、SFN、AR、CUL1、EGFR、PTEN、SHC、SPP1;漢族組表達(dá)下調(diào)的基因2個(gè):TP53和Sumo2。哈族組上調(diào)的基因7個(gè):EGFR、NEDD8、VCP、UBD、AR、MMP2、UBE2I;哈族組表達(dá)下調(diào)的基因2個(gè):BCL2和CUL3。應(yīng)用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)比較5個(gè)基因:AR、EGFR、MMP2、UBD以及VIM在癌組織與遠(yuǎn)端正常組織中蛋白表達(dá)均具差異。3）在5-aza-dc組表達(dá)下調(diào)的基因有

7、5個(gè):AR、ARRB2、CAND1、MAPK14、MYC。表達(dá)增強(qiáng)的基因有3個(gè):UBD、UBE2I以及PTEN。TSA組下調(diào)的基因有6個(gè):ARRB2、CAND1、HSP90AA1、MAPK14、UBD以及MYC;表達(dá)上調(diào)的基因有2個(gè):AR和UBE2I。5-aza-dC+TSA聯(lián)合組，兩因素對(duì)基因表達(dá)表現(xiàn)拮抗作用1個(gè):AR，協(xié)同作用下調(diào)的基因有3個(gè):MAPK14、UBD及UBE2I。Lrig1過表達(dá)導(dǎo)致ECA109細(xì)胞下調(diào)的基因有5個(gè):A

8、R、MMP2、HSP90AA1、MGMT、SUMO2。
　　結(jié)論:1）網(wǎng)絡(luò)分析提示Hub基因蛋白與食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展具有相關(guān)性。2）大部分Hub基因在腫瘤和正常組織都呈陽性表達(dá)，提示這些基因具有重要的生物學(xué)功能，它們的異常表達(dá)可能會(huì)出現(xiàn)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，譬如在漢族異常表達(dá)的13個(gè)基因以及哈族標(biāo)本異常表達(dá)的9個(gè)基因，分布在眾多與腫瘤相關(guān)的生物學(xué)調(diào)控途徑。3）5-aza-DC作用ECA109細(xì)胞后，AR、ARRB2、CAND1、

9、MAPK14、MYC表達(dá)降低，可能系與其表達(dá)相關(guān)的抑癌基因的轉(zhuǎn)錄活性恢復(fù)有關(guān);UBD、UBE2I、PTEN表達(dá)增強(qiáng)，機(jī)制可能由于其啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)的改變有關(guān)。TSA藥物調(diào)控后，AR和UBE2I基因表達(dá)上調(diào)，說明其基因啟動(dòng)子區(qū)乙酰化水平的變化可以直接參與其基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。Lrig1組AR、MMP2、HSP90AA1、MGMT以及SUMO2表達(dá)下調(diào)，其調(diào)控機(jī)制可能為Lrig1作為EGFR的抑制因子導(dǎo)致EGFR活性降低，進(jìn)而影響了這些基因