Bridging integrator1在胃腺癌中的表達(dá)及其預(yù)后價(jià)值.pdf

1、胃癌是世界第4大常見(jiàn)腫瘤。盡管近半世紀(jì)以來(lái)全球胃癌發(fā)病率有所下降，但在中國(guó)的發(fā)病卻率逐年上升。胃癌的分類可分為早期胃癌及進(jìn)行性胃癌，臨床表現(xiàn)癥狀則是模糊且不具特異性。大部份診斷出胃癌的病人被發(fā)現(xiàn)時(shí)都已經(jīng)是進(jìn)行性疾病來(lái)呈現(xiàn)。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)超過(guò)50％的病人會(huì)進(jìn)行手術(shù)，但是手術(shù)之后，大約60-70％的病人發(fā)生轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移性的胃癌仍然是一種無(wú)法治愈的疾病。一般而言，胃癌病人平均五年的存活率大約22％左右，而晚期胃癌患者的五年的存活率更小于5％以下?；瘜W(xué)

2、療法已經(jīng)成為胃癌治療不可缺少的方法之一，緩和的化學(xué)療法已經(jīng)被證明能提高存活率或末期生活品質(zhì)。近年來(lái)科研人員一直在努力深入理解胃癌的生物學(xué)特性，以期提高早期診斷、預(yù)后和最終治愈，然而由于缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的化療、放療和手術(shù)切除，晚期胃癌患者的治療結(jié)果很不理想。因此，闡明胃癌的發(fā)病機(jī)制，爭(zhēng)取早期診斷，尋求有效的治療手段是亟待解決的重要課題。胃癌的發(fā)展是受多種因素影響，許多致癌基因和腫瘤抑制基因參與其中，而最主要的是遺傳學(xué)及表觀學(xué)的異常。其中癌基因

3、的激活與抑癌基因的失活是其重要的遺傳學(xué)基礎(chǔ)。相對(duì)于因功能獲得性變異而導(dǎo)致的癌基因激活，抑癌基因的失活源自功能失去性變異，提高了腫瘤易感性，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著更大的最用。鑒定參與胃癌形成的新基因，對(duì)這些基因的生物學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，將有助于我們開(kāi)發(fā)早期診斷方法，進(jìn)行靶向治療。
　　 本研究課題以與胃腺癌相關(guān)的候選抑癌基因BIN1為研究對(duì)象，檢測(cè)了它們?cè)谖赶侔┲械谋磉_(dá)情況，并初步探討了關(guān)于預(yù)后方面的可能因素。
　　 B

4、ridging integrator1(BIN1)是由染色體2q14-2q21上長(zhǎng)度達(dá)59258 bps的DNA片段中的16個(gè)外顯子編碼，是新鑒定的有腫瘤抑制基因特征的人類基因產(chǎn)物。BIN1最初是由于它可干涉并抑制cMyc誘導(dǎo)的癌變而被鑒定的。Sakamuro等發(fā)現(xiàn)在人乳腺癌細(xì)胞株MCF7和乳腺癌組織中存在BIN1的缺失。另一些研究發(fā)現(xiàn)BIN1基因在乳腺癌、前列腺癌和惡性黑素瘤中表達(dá)下調(diào)或失活，其異位再表達(dá)與細(xì)胞程序化死亡過(guò)程有關(guān)。Ka

5、i等發(fā)現(xiàn)BIN1的缺失與乳腺癌進(jìn)展有關(guān)。此外，在小鼠模型中敲除BIN1基因18-20個(gè)月后，50％的小鼠自發(fā)產(chǎn)生肺癌，10％的小鼠產(chǎn)生肝癌。上述結(jié)果提示BIN1可能具有腫瘤抑制基因的功能。本研究詣在檢測(cè)BIN1在胃腺癌中的表達(dá)情況，分析其與臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系，探討其在危險(xiǎn)中發(fā)揮的作用機(jī)制。
　　 材料與方法:
　　 患者腫瘤組織樣本
　　 經(jīng)南方醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)和簽署知情同意書(shū)后，從2003年到2006年

6、之間在南方醫(yī)院接受手術(shù)的胃腺癌患者中，獲得234份石蠟包埋的胃腺癌樣本。所有的患者均未接受術(shù)前治療?；颊甙?57位男性和77位女性，平均年齡58歲（年齡范圍為17-84歲）。所有的組織塊均切割成4μm厚連續(xù)切片。組織學(xué)分型按照世界衛(wèi)生組織的分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。從2005年到2007年之間在南方醫(yī)院接受手術(shù)切除的胃腺癌患者中，獲得另外共計(jì)51份新鮮腫瘤組織和相鄰的非腫瘤組織樣本。患者均未接受任何術(shù)前治療?；颊甙?2位男性和19位女性，平均年

7、齡50歲（年齡范圍為21-76歲）。所獲得的組織樣本立即浸入RNAlater(Ambion Inc.，USA)，保存于-80℃。所有的患者均按照第7版國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)的腫瘤、淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(TNM)分期系統(tǒng)進(jìn)行分期。
　　 熒光定量PCR(RT-qPCR)
　　 按照廠商說(shuō)明，使用TRIzol溶液（美國(guó)Invitrogen公司）從約150mg原發(fā)性腫瘤中提取總RNA。使用無(wú)RNase的DNase消除DNA污染。

8、用NANO DROP分光光度計(jì)(ND-1000型，美國(guó)Thermo Scientific公司)在260 nm測(cè)得光密度值，計(jì)算總RNA濃度。根據(jù)廠商的建議，使用2μg總RNA和M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶（美國(guó)Promega公司）反轉(zhuǎn)錄(RT)合成第一條鏈cDNA。所產(chǎn)生的cDNA進(jìn)行熒光定量PCR，對(duì)GAPDH（內(nèi)參基因）和BIN1的相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行評(píng)估。相應(yīng)的引物對(duì):BIN1sense:5'-ACAACGACCTGCTGTGGATGG-3';

9、BIN1 antisense:5'-CGTGACTTGATGTCGGGGAACT-3';GAPDHsense:5'-CTCCTCCTGTTCGACAGTCAGC-3';GAPDHantisense:5'-CCCAATACGACCAAATCCGTT-3'。使用Roche LightCycler(@)480熒光定量PCR儀進(jìn)行基因特異性擴(kuò)增。15μl PCR反應(yīng)混合物包括:0.5μl按上述方法合成的cDNA，7.5μl2×SYBR Gree

10、n主混合液（美國(guó)Invitrogen公司）以及每對(duì)寡核苷酸引物200 nM。擴(kuò)增反應(yīng)條件為:在95oC變性10分鐘，95oC30秒和60oC退火60秒，共45個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本檢測(cè)兩次，每個(gè)實(shí)驗(yàn)使用從不同反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，至少重復(fù)兩次。通過(guò)比較2-ΔΔCt值進(jìn)行相對(duì)定量分析。
　　 免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry，IHC)分析
　　 從石蠟包埋的胃腺癌組織塊切割厚度為4μm的組織切片。切片脫石蠟，

11、用乙醇梯度再水化。對(duì)于抗原修復(fù)，切片在Target Retrieval Solution(Dako)中于99-100℃蒸20分鐘。用phosphate buffered solution(PBS)沖洗后，用3％ H2O2在室溫下進(jìn)行蛋白質(zhì)封閉20分鐘。組織切片與BIN1一抗(美國(guó)Santa Cruz)（1∶200稀釋）在4oC孵育過(guò)夜。用PBS洗滌3次后，切片與生物素化的二抗(DAKO)在室溫下孵育30分鐘。最后用3，3'二氨基聯(lián)苯胺四

12、鹽酸(DAB，DAKO)顯影可視信號(hào)，所有的切片都用蘇木精復(fù)染。
　　 IHC染色結(jié)果的半定量分析如下:陰性-0:腫瘤細(xì)胞無(wú)染色;弱陽(yáng)性-1∶10％腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性;中度陽(yáng)性-2∶11％到50％腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性;強(qiáng)陽(yáng)性-3∶50％以上腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性。BIN1免疫染色得分范圍從0到9。我們對(duì)BIN1表達(dá)水平定義如下:‘-’(得分0-1);‘+’(得分2-3);‘++’(得分4-6);‘+++’（得分＞6）。在本研究中，‘-’代表陰性表達(dá)，‘

13、+’，‘++’和‘+++’屬于陽(yáng)性表達(dá)。
　　 蛋白質(zhì)印跡分析
　　 在RIPA裂解緩沖液中使胃腺癌組織和非腫瘤組織裂解。在12％ SDS PAGE膠中分離30μg蛋白質(zhì)樣品，之后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5％脫脂牛奶封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)1小時(shí)后，用BIN1多克隆一抗（1∶2000稀釋，美國(guó)Proteintech公司）在4 oC孵育過(guò)夜。用TBST洗滌膜三次之后，用適當(dāng)?shù)亩古c膜在室溫下孵育1小時(shí)。然后使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)

14、(ECL，美國(guó)Pierce公司)進(jìn)行膜檢測(cè)。
　　 統(tǒng)計(jì)分析
　　 所有的統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS17.0軟件（美國(guó)芝加哥SPSS公司）。成對(duì)樣本t-test用于比較在腫瘤組織樣本和相鄰非腫瘤組織樣本中的BIN1 mRNA水平。使用x2檢驗(yàn)和Pearson相關(guān)系數(shù)分析BIN1表達(dá)和各種臨床病理學(xué)特征之間的相關(guān)性。使用Kaplan-Meier方法計(jì)算存活曲線并通過(guò)時(shí)序檢驗(yàn)進(jìn)行比較。對(duì)于單因素和多因素分析，使用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型

15、研究臨床病理學(xué)變化和BIN1表達(dá)對(duì)存活的影響。雙側(cè)檢驗(yàn)的P值＜0.05可認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1)使用RT-qPCR對(duì)51對(duì)胃癌腫瘤組織和相鄰非腫瘤組織的BIN1轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了研究。與在相鄰非腫瘤組織中的BIN1 mRNA水平相比較，在40個(gè)(78.4％)腫瘤組織樣本中BIN1 mRNA水平顯著降低(P=0.0015)。
　　 2)用免疫組化方法檢測(cè)經(jīng)組織病理學(xué)證實(shí)的胃腺癌組織切片(n=234)

16、。BIN1在腫瘤組織和相鄰的非腫瘤組織中的表達(dá)水平有所不同。在234位胃癌患者中，有106位(45.3％)患者的BIN1表達(dá)水平較高，有128位(54.7％)患者的BIN1表達(dá)水平較低。在低分化的胃癌患者中(G3)，BIN1的表達(dá)顯著下降(P＜0.001)。在深度侵襲(T4)(P＜0.001)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N）(P＜0.001)的腫瘤中可較多地觀察到BIN1表達(dá)下降。另外，144位Ⅲ期和Ⅳ期患者中有92位(63.9％)的BIN1表達(dá)水平

17、較低(P＜0.001)。使用單因素和多因素分析，比較了BIN1表達(dá)和其他臨床病理學(xué)參數(shù)對(duì)胃癌患者預(yù)后的影響。單因素分析表明有6個(gè)因素對(duì)總存活率的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，包括腫瘤大小(P＜0.001)，根治切除(P＜0.001)，BIN1表達(dá)(P＜0.001)，以及T期(腫瘤侵襲深度，P＜0.001)，N期(淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，P＜0.001)和M期(轉(zhuǎn)移，P＜0.001)，根據(jù)第7版UICC TNM分類進(jìn)行分期。其后的多因素分析結(jié)果表明，腫瘤大小(P

18、＜0.031)，BIN1表達(dá)(P＜0.009)，T期(腫瘤侵襲深度，P＜0.018)和N期(淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，P＜0.004)是胃腺癌患者總存活率的獨(dú)立影響因子。BIN1低表達(dá)患者的相對(duì)死亡風(fēng)險(xiǎn)高于BIN1高表達(dá)患者0.552倍(HR=0.552，95％CI=0.354-0.862)。
　　 3)使用Kaplan-Meier存活曲線和時(shí)序檢驗(yàn)(log-rank test)評(píng)估BIN1對(duì)胃腺癌患者總成活率的預(yù)后影響。結(jié)果證實(shí)BIN1低表

19、達(dá)患者的預(yù)后明顯比BIN1高表達(dá)患者差[72.6 vs.43.9％（總存活率）和72.6 vs.53.1％（5年存活率），P＜0.001]。
　　 4)通過(guò)蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)了胃癌患者的BIN1蛋白水平。與在相鄰非腫瘤組織中的BIN1蛋白水平相比較，在51個(gè)腫瘤組織樣本中有33個(gè)(64.7％)樣本的BIN1蛋白表達(dá)水平下降(P=0.012)。
　　 結(jié)論:
　　 本研究使用大量臨床樣本，通過(guò)RT-qPCR，免疫組織化