鎂離子誘導裂解型沙門菌DNA疫苗運送系統(tǒng)的建立及初步應用.pdf

1、高致病性禽流感(HPAI)是由正粘病毒科A型流感病毒引起的一類禽類病毒性傳染病。該病不但嚴重影響?zhàn)B禽業(yè)的發(fā)展和國際貿易，而且對人類健康也構成越來越大的威脅。常規(guī)滅活苗對控制禽流感的發(fā)生流行起到了非常重要的作用，但也存在難以克服的缺點，如存在散毒的潛在危險、不能有效激發(fā)細胞和黏膜免疫應答等，因此需要研究一種安全、高效的新型疫苗克服上述不足。 減毒沙門菌可作為疫苗載體，通過自然黏膜感染途徑運送DNA疫苗至宿主特定的免疫器官和細胞，表

2、達外源抗原，激發(fā)機體產生保護性的細胞、體液和黏膜免疫應答。減毒沙門菌作為載體可用于運送禽流感DNA疫苗，為禽流感的防治帶來新思路和新手段。 沙門菌侵入細胞后并不能迅速進入胞液并釋放內含的DNA疫苗，已經成為重組沙門菌疫苗載體研究的阻礙之一。本研究構建了一種鎂離子調控的沙門菌裂解系統(tǒng)，該系統(tǒng)在胞內低鎂離子濃度下會發(fā)生裂解，從而釋放出所攜帶的DNA疫苗。在此基礎上，構建出運送禽流感DNA疫苗的減毒鼠傷寒沙門菌，并對其免疫特性作初步探

3、討。 1鎂離子誘導裂解型沙門菌運送系統(tǒng)的構建與鑒定將本室構建的融合基因“S107”插入非抗性篩選DNA疫苗載體pPL的Mlu I位點，構建真核表達質粒pPL107。融合基因“S107”是由將Mg2+運輸蛋白基因mgtC/B的啟動子Pmgt置于λ噬菌體裂解基因之前構建成功，這樣可以通過控制培養(yǎng)基中Mg2+的濃度使裂解基因在沙門菌中表達。將紅色熒光蛋白DsRed基因分別連入pPL107和pPL中，構建出重組表達質粒pPL107DsR

4、ed和pPLDsRed。重組表達質粒pPL107DsRed和pPLDsRed分別轉染COS-7細胞，24h后，在熒光顯微鏡下觀察到強烈的紅色熒光。上述重組表達質粒通過電轉化轉入SifA基因突變型鼠傷寒沙門菌X4550°，經篩選鑒定獲得陽性轉化子，分別命名為X4550*(pPL107DsRed)和X4550*(pPLDsRRed)。 將X4550*(pPL107DsRed)和X4550*(pPLDsRed)預培養(yǎng)的菌液分別洗滌，并

5、重懸于N基礎培養(yǎng)基，當培養(yǎng)基中Mg2+濃度很低時，融合基因“S107”發(fā)生表達，X4550*(pPL107DsRed)在2h內就會發(fā)生裂解，約80％的細菌死亡，并可在溶液中檢測出釋放的重組真核表達質粒pPL107DsRed，當在培養(yǎng)基中添加了足量的Mg2+時，融合基因“S107”的表達就會受到抑制。X4550*(pPL107DsRed)LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，其生長能力與X4550*(pPLDsRed)沒有明顯差異。體外真核表達質粒遞送試

6、驗顯示，X4550*(pPL107DsRed])可以將真核表達質粒運送給巨噬細胞系RAW264.7，并表達紅色熒光蛋白，說明該系統(tǒng)可將自身攜帶的DNA疫苗傳遞給真核細胞。本研究獲得了在體內自我誘導宿主菌有效裂解釋放DNA疫苗的方法，這為進一步研究和利用該DNA疫苗輸送系統(tǒng)奠定了基礎。 2鎂離子誘導裂解型沙門菌運送H5亞型禽流感病毒DNA疫苗免疫原性的初步研究利用限制性內切酶BamH I和Nhe I切出pVAXl-HA上的HA基因

7、，并連入相應酶切的pPL107和pPL載體中，BamH I和Nhe I酶切電泳鑒定正確，獲得重組表達質粒pPL107HA和pPLHA。重組表達質粒轉染COS-7細胞，間接免疫熒光試驗表明，HA基因在COS-7細胞中獲得表達。通過電穿孔轉化法，將pPLl07HA和pPLHA轉入StfA基因突變型減毒鼠傷寒沙門菌X4550*中，抽提質粒后酶切鑒定正確，從而獲得攜帶DNA疫苗的重組沙門菌，分別命名為X4550*(pPL107HA)和X4550

8、*(pPLHA)。重組菌X4550*(pPL107HA)和X4550*(pPLHA)以每只1 × 107 CFU的劑量靜脈注射免疫6周齡雌性BALB/c小鼠，兩周后以同樣的方法進行第二次免疫。二免后兩周，各重組菌免疫組測得的針對禽流感病毒HA蛋白的特異性血清抗體都較低。用制備的H5亞型禽流感病毒作腹腔注射，2周后重組菌X4550*(pPL107HA)和X4550*(pPLHA)均可測得針對禽流感病毒HA蛋白的特異性血清抗體，并且重組菌X

9、4550*(pPL107HA)免疫組與重組菌X4550*(pPLHA)免疫組能激發(fā)出較對照組更強的血清抗體水平。在刺激小鼠脾臟T淋巴細胞增殖方面，各免疫組在二免后兩周均能刺激淋巴細胞增殖，但重組菌X4550*(pPL107HA)免疫組可以激發(fā)出較X4550*(pPLHA)免疫組以及對照組更強的針對HA蛋白的細胞免疫應答，差異顯著(P<0.05)。上述結果說明，對于沙門菌介導的DNA疫苗來說，提高沙門菌釋放DNA疫苗的能力有助于提高免疫效