S100A8-A9對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響.pdf

1、目的：研究S100A8/A9對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥介質(zhì)產(chǎn)生的影響以及S100A8/A9激活小膠質(zhì)細(xì)胞所涉及的相關(guān)信號(hào)通路，以探討S100A8/A9在小膠質(zhì)細(xì)胞中促炎作用的機(jī)制。方法：用含10％胎牛血清的高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)bv-2細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)分為9組：（1）對(duì)照組：用含0.035%乙醇的培養(yǎng)基處理；（2）LPS組：用含0.035%乙醇的培養(yǎng)基處理2小時(shí)后加終濃度為1μg/ml LPS的處理小膠質(zhì)細(xì)胞作為陽性對(duì)照；（3）用S100A8/A9組：含0.0

2、35%乙醇的培養(yǎng)基處理2小時(shí)后加不同濃度的S100A8/A9（0.01μM,0.1μM,1.0μM）處理；（4）C225+S100A8/A9組：在用0.1μM S100A8/A9處理前加1μg/ml C225處理2小時(shí)；（5）RAGE封閉抗體+S100A8/A9組：在用0.1μM S100A8/A9處理前加166μg/ml RAGE封閉抗體處理2小時(shí)；（6）PD98059+S100A8/A9組：在用0.1μM S100A8/A9處理前加

3、20μM PD98059處理2小時(shí)；（7） SB203580+S100A8/A9組：在用0.1μM S100A8/A9處理前加7μM SB203580處理2小時(shí)；（8）SP600125+S100A8/A9組：在用0.1μM S100A8/A9處理前加10μM SP600125孵育2小時(shí)；（9）PDTC+S100A8/A9組：在用0.1μM S100A8/A9處理前加50μM PDTC處理2小時(shí)。ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中白介素-6（

4、interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）的濃度；real-time PCR檢測(cè)細(xì)胞IL-6和TNF-αmRNA的表達(dá)水平；免疫顯微鏡觀察NF-κB p65亞基在細(xì)胞內(nèi)定位的變化；Western blotting檢測(cè)細(xì)胞p65亞基的轉(zhuǎn)位；電泳遷移率分析（electrophoretic mobility shift assays，EMSA）檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子NF

5、-κB的DNA結(jié)合活性。
　　結(jié)果：○1不同濃度的S100A8/A9刺激BV-2細(xì)胞12h，細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IL-6和TNF-α水平均顯著升高(P<0.01)；○2 S100A8/A9刺激預(yù)先使用C225孵育的小膠質(zhì)細(xì)胞，培養(yǎng)基中炎癥因子 IL-6和TNF-α的含量比 S100A8/A9單獨(dú)刺激的要低（P<0.05）；○3 S100A8/A9刺激預(yù)先使用RAGE封閉抗體孵育的小膠質(zhì)細(xì)胞，培養(yǎng)基中炎癥因子IL-6和TNF-α的含量比

6、S100A8/A9單獨(dú)刺激的要低（P<0.05）；○4 S100A8/A9刺激預(yù)先使用ERK阻斷劑（PD98059）孵育的小膠質(zhì)細(xì)胞，培養(yǎng)基中炎癥因子IL-6和TNF-α的含量比S100A8/A9單獨(dú)刺激的要低（P<0.05）；○5 S100A8/A9刺激預(yù)先使用JNK阻斷劑（SB600125）孵育的小膠質(zhì)細(xì)胞，培養(yǎng)基中炎癥因子IL-6和TNF-α的含量比S100A8/A9單獨(dú)刺激的要低（P<0.05）；○6 P38阻斷劑（SB2035

7、80）對(duì)S100A8/A9誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生無明顯影響（P>0.05）；○7 S100A8/A9刺激預(yù)先使用NF-κB阻斷劑（PDTC）孵育的小膠質(zhì)細(xì)胞，培養(yǎng)基中炎癥因子IL-6和TNF-α的含量比S100A8/A9單獨(dú)刺激的要低（P<0.05）；○8與S100A8/A9組相比，加入PD98059、SP600125后刺激小膠質(zhì)細(xì)胞4小時(shí)，IL-6和TNF-αmRNA的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.01）；○9細(xì)胞免疫熒光顯示0

8、.1μM S100A8/A9刺激BV-2細(xì)胞可誘導(dǎo)NF-κB p65亞基核轉(zhuǎn)位，Western blotting結(jié)果顯示S100A8/A9刺激的小膠質(zhì)細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65的蛋白含量升高（P<0.05），同時(shí)PD98059、SP600125預(yù)處理組的細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65蛋白含量比S100A8/A9組降低（P<0.05）；1○0EMSA結(jié)果顯示，0.1μM S100A8/A9使轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的DNA結(jié)合活性增加。