cF-mtDNA誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)及其影響衰老和肥胖的研究.pdf

1、現(xiàn)代社會(huì)，衰老和肥胖無(wú)疑已經(jīng)成為日益嚴(yán)重的全球公共健康問題和臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。兩者緊密相關(guān)，存在很多共性，特別是引起它們的首要原因都是能量代謝失衡。越來(lái)越多的臨床病例和實(shí)驗(yàn)研究證明，下丘腦作為能量代謝控制中心，同時(shí)也是衰老和肥胖的重要生理病理基礎(chǔ);下丘腦慢性炎癥可能是整個(gè)機(jī)體衰老和肥胖的共同根源;而核因子κB(Nuclear factorκB，NF-κB)炎癥通路的激活在下丘腦慢性炎癥中起關(guān)鍵作用。另外，小膠質(zhì)細(xì)胞，相當(dāng)于中樞神經(jīng)

2、系統(tǒng)中的巨噬細(xì)胞，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的第一道也是最主要的一道免疫防線，與衰老和肥胖也有重要關(guān)聯(lián)。然而一直以來(lái)研究人員對(duì)于下丘腦小膠質(zhì)細(xì)胞在衰老和肥胖中所扮演的角色知之甚少。我們前期關(guān)于衰老的研究表明，NF-κB及其上游IκB激酶β(IκB kinase-β，IKK-β)的激活最早發(fā)現(xiàn)于下丘腦小膠質(zhì)細(xì)胞中，再慢慢擴(kuò)散至神經(jīng)元。但下丘腦小膠質(zhì)細(xì)胞IKK-β/NF-κB通路激活的起因以及其在衰老或肥胖發(fā)生發(fā)展中的具體作用尚未闡明。
　　小

3、膠質(zhì)細(xì)胞也是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)細(xì)胞因子的重要來(lái)源和作用部位，它通過大量細(xì)胞因子進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)和免疫調(diào)節(jié)。其中，巨噬細(xì)胞集落刺激因子（Macrophage colony-stimulating factor，M-CSF）、粒細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)和粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子（Granulocyte/macrophage colony-stimulating f

4、actor，GM-CSF）最初因能刺激造血祖細(xì)胞向巨噬細(xì)胞或/和中性粒細(xì)胞分化而命名，但是越來(lái)越多的研究表明，它們的作用不局限于血細(xì)胞生長(zhǎng)因子，與其他細(xì)胞因子的緊密聯(lián)系，使它們擁有更廣泛的作用。相關(guān)的體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)都表明，這三種集落刺激因子對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞有著重要的生物學(xué)作用。而且，研究者們已確認(rèn)Mcsf, Gcsf和Gmcsf基因都是NF-κB的靶基因，相關(guān)報(bào)道稱這三種集落刺激因子都在機(jī)體能量代謝中起關(guān)鍵作用。
　　另外，不同于經(jīng)典

5、的炎癥反應(yīng)是發(fā)生在感染等疾病條件下，引起衰老或肥胖的慢性炎癥往往與胞內(nèi)細(xì)胞器的能量代謝失衡有關(guān)，特別是細(xì)胞的“能量工廠”-線粒體。同細(xì)菌DNA一樣，線粒體DNA(Mitochondrial DNA，mtDNA)為共價(jià)閉合環(huán)狀雙鏈分子，缺少組氨酸保護(hù)且含有大量未甲基化的CpG序列。在正常情況下，由于mtDNA存在于線粒體內(nèi)，與免疫系統(tǒng)隔離而不被識(shí)別;但當(dāng)線粒體損傷或膜通透性增加等原因?qū)е耺tDNA釋放到線粒體外或細(xì)胞外，從而可能引起免疫反

6、應(yīng)。越來(lái)越多的研究報(bào)道當(dāng)mtDNA釋放到細(xì)胞外時(shí)，它可作為一種特殊的損傷相關(guān)分子模式(Damage-associatedmolecular pattern，DAMP)分子引起炎癥。除重癥感染和創(chuàng)傷外，在多種腫瘤中的血清或血漿中也發(fā)現(xiàn)這種游離線粒體DNA(Cell free mtDNA，cf-mtDNA)水平改變，學(xué)者們建議可將其作為一種非侵入性評(píng)價(jià)疾病的風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物。但是目前，在衰老和肥胖的mtDNA研究中，主要關(guān)注的仍是m

7、tDNA的突變、缺失或細(xì)胞內(nèi)mtDNA含量的變化及作用，對(duì)cf-mtDNA的研究則較少。
　　因此本文遵循著由淺入深的原則，首先通過細(xì)胞體外研究，全面闡述cf-mtDNA誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的機(jī)制;利用衰老、肥胖以及第三腦室套管小鼠模型，闡述衰老或肥胖對(duì)腦脊液cf-mtDNA和下丘腦集落刺激因子水平的影響，并解析下丘腦cf-mtDNA或集落刺激因子升高對(duì)小鼠代謝的作用;最后通過慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)和Cre-lox或Cre-STOP-l

8、ox系統(tǒng)建立下丘腦小膠質(zhì)細(xì)胞IKK-β敲除和激活小鼠模型，進(jìn)一步闡明下丘腦小膠質(zhì)細(xì)胞NF-κB通路對(duì)衰老和肥胖的影響。
　　第1部分:cf-mtDNA誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)。我們首先采用振搖法和溫和消化法相結(jié)合在原代混合培養(yǎng)的膠質(zhì)細(xì)胞中分離出小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，并分別進(jìn)行形態(tài)觀察和免疫熒光染色等鑒定純度。采用蔗糖密度梯度離心等從C57BL/6小鼠大腦中分離并純化得到線粒體和細(xì)胞核，再分別采用堿裂解法和酚氯仿抽提法進(jìn)行mtDN

9、A和核DNA(Nuclear DNA，nDNA)分離和純化。構(gòu)建分別包含小鼠線粒體基因和核基因的兩組標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，建立檢測(cè)mtDNA拷貝數(shù)的實(shí)時(shí)熒光PCR絕對(duì)定量方法。通過mtDNA或nDNA刺激BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞、原代小膠質(zhì)細(xì)胞、原代星形膠質(zhì)細(xì)胞、GT1-7神經(jīng)元細(xì)胞、CAIKK-β(Constitutively active IKK-β)/BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞和DNIκBα(Dominant-negativeIκBα)/BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞

10、等的體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞外游離的mtDNA增多可以靈敏地激活NF-κB通路從而引起小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)并促使小膠質(zhì)細(xì)胞集落刺激因子表達(dá)增高;而小膠質(zhì)細(xì)胞外M-CSF增多又可進(jìn)一步促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞外游離的mtDNA增多，G-CSF和GM-CSF增多反而促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞外游離的mtDNA減少。
　　第2部分:腦脊液cf-mtDNA和下丘腦集落刺激因子與衰老和肥胖的關(guān)系以及影響。我們采用小鼠延髓池采集腦脊液，并利用實(shí)時(shí)熒光PCR絕對(duì)定量方法

11、測(cè)定小鼠腦脊液中cf-mtDNA拷貝數(shù)。通過比較老年小鼠（28～30月齡）和性別相匹配的年輕小鼠（3月齡）以及不同時(shí)間段的高脂飲食（High fat diet，HFD）小鼠和常規(guī)飲食（Chow，年齡和性別相匹配）小鼠，發(fā)現(xiàn)衰老和長(zhǎng)時(shí)間(12周)HFD引起的肥胖會(huì)導(dǎo)致腦脊液中cf-mtDNA水平和下丘腦中集落刺激因子表達(dá)升高。通過第三腦室預(yù)先埋置套管，再通過第三腦室注射集落刺激因子或mtDNA，發(fā)現(xiàn)M-CSF會(huì)引起小鼠攝食量增加、體重增加

12、和葡萄糖耐量受損;G-CSF、GM-CSF和mtDNA可以引起小鼠攝食量減少、體重減少和葡萄糖耐量受損。
　　第3部分:下丘腦小膠質(zhì)細(xì)胞NF-κ B通路對(duì)衰老和肥胖的影響。我們采用在16周齡的Ikbkblax/lax小鼠的兩側(cè)下丘腦內(nèi)側(cè)基底部(Mediobasalhypothalamus，MBH)注射包裝有CD11b啟動(dòng)子（小膠質(zhì)細(xì)胞特有）和Cre的慢病毒，通過Cre-lox系統(tǒng)建立下丘腦小膠質(zhì)細(xì)胞的IKK-βKO小鼠模型。術(shù)后即

13、開始HFD喂養(yǎng)30周后改成chow喂養(yǎng)直至整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束。通過監(jiān)測(cè)體重、攝食量、全身核磁共振成像、代謝籠實(shí)驗(yàn)、葡萄糖耐量測(cè)試、抓力實(shí)驗(yàn)、尾腱斷裂實(shí)驗(yàn)、肌肉和皮膚的組織學(xué)檢測(cè)、Western blotting分析下丘腦NF-κB激活情況和熒光定量PCR分析下丘腦集落刺激因子表達(dá)情況等，發(fā)現(xiàn)在HFD喂養(yǎng)時(shí)小鼠下丘腦小膠質(zhì)細(xì)胞IKK-β敲除具有抗肥胖作用，在衰老情況下小鼠下丘腦小膠質(zhì)細(xì)胞IKK-β敲除具有維持體重并抵抗衰老的作用。我們還采用在1

14、6周齡的R26-StopFL Ikbkbca小鼠的MBH注射包裝有CD11b啟動(dòng)子和Cre的慢病毒，通過Cre-STOP-lox系統(tǒng)建立下丘腦小膠質(zhì)細(xì)胞的CAIKK-β小鼠模型。通過監(jiān)測(cè)體重、攝食量、葡萄糖耐量測(cè)試和組織學(xué)檢測(cè)（脂肪、肌肉和皮膚），發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞的IKK-β持續(xù)激活可以促進(jìn)體重減少和促進(jìn)衰老發(fā)展。
　　總之，本文揭示了小膠質(zhì)細(xì)胞NF-κB通路介導(dǎo)的cf-mtDNA/集落刺激因子相互作用機(jī)制，并首次詳細(xì)闡述了衰老和肥