一種新型升血小板基因工程產品制備工藝優(yōu)化及質量標準研究.pdf

1、血小板減少癥在臨床治療中較為常見,嚴重的血小板水平低下直接威脅著人體生命安全。血小板減少性紫癜、腫瘤放/化療、再生障礙性貧血及骨髓移植等許多因素都能引起血小板減少。目前,臨床上應對血小板減少的主要治療方法仍然是直接輸注血小板;然而,血小板輸注存在著輸血反應、病原體感染等多種隱患。已知血小板由骨髓巨核細胞產生,因而通過對巨核細胞增殖分化進行調控可以達到促進血小板生成的目的。所以,能夠促進巨核細胞增殖分化的造血生長因子類基因工程藥物越來越受

2、到人們的廣泛關注。
　　血小板生成素(thrombopoietin, TPO),也稱為巨核細胞生長發(fā)育因子(megakaryocyte growth and development factor, MGDF),是調節(jié)巨核細胞增殖分化和血小板生成的重要細胞因子,可通過與受體(c-Mpl)的結合,激活巨核細胞中相應的信號通路,發(fā)揮其促巨核細胞增殖分化的作用。人們利用基因重組方法,研制出聚乙二醇化的重組人巨核細胞生長發(fā)育因子(pegyl

3、ated recombinant human megakaryocyte growth and development factor, PEG-rhMGDF)和重組人血小板生成素(recombinant human thrombopoietin, rhTPO)兩種第一代促進血小板生成基因工程藥物。但是,PEG-rhMGDF在美國進行二期臨床試驗時,發(fā)現其能誘導產生與內源性TPO起交叉反應的中和性抗體,反而使患者血小板水平進一步降低。因此

4、,美國FDA隨即全面禁止了重組人TPO基因工程藥物的臨床實驗。之后,人們又用噬菌體表面展示技術篩選出一種由14個氨基酸組成的TPO模擬肽(thrombopoietin mimetic peptide, TMP),它與TPO無同源序列,但與 c-Mpl具有較高親和力。研究表明,TMP尤其是其二聯體(dTMP)不僅能促進巨核細胞增殖,并且不會誘導產生 TPO中和性抗體。然而,由于 TMP分子量只有1.5KD,通過基因工程制備難度較大,并且在

5、體內循環(huán)中極易被降解。
　　已有研究表明,人生長激素(human growth hormone, hGH)對骨髓造血干細胞的增殖和/或分化具有重要調控作用,并且發(fā)現在體內應用后可加速血小板水平恢復。hGH可通過與其受體(growth hormone receptor, GHR)結合發(fā)揮生物學活性,該受體與c-Mpl為同類細胞因子受體,可激活相似的信號通路。因此,本室將GH與dTMP進行融合,構建出重組融合蛋白分子 dTMP-GH,

6、以期發(fā)揮協同促進巨核細胞增殖及血小板生成作用。另一方面,融合蛋白dTMP-GH的分子量為26KD,較單純TMP更容易進行基因工程制備,且可望延長其體內半衰期。
　　前期工作中,我們已構建并篩選出特異性表達 dTMP-GH的工程菌株,并進行了實驗室水平的小規(guī)模制備。在此基礎上,為放大生產,滿足新藥申報要求,本研究進一步對融合蛋白 dTMP-GH在大腸桿菌中的高效表達和純化制備工藝進行了優(yōu)化,最終實現了該重組融合蛋白的中試放大生產,獲

7、得純度大于98％的目標產品,并對該融合蛋白的質量標準及體內分布進行了初步研究。主要研究結果與結論如下:
　　1.基于已有的dTMP-GH表達菌株,通過對培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間的優(yōu)化,成功將從一個單克隆到獲得目的蛋白菌體整個酵表達過程控制在30小時以內,含目的蛋白的濕菌產量達50g/L,目的蛋白表達量占總蛋白的25%,高壓勻漿破菌后dTMP-GH包涵體含量達到50%以上。
　　2.為提高效率和處理量,采用超濾法代替透析

8、法對包涵體進行復性。通過對純化條件的優(yōu)化,目前單次純化所得融合蛋白 dTMP-GH的量達到克級,產品純度大于>98%。
　　3.對融合蛋白dTMP-GH的分子量、等電點、氨基酸序列、純度等理化特性及其凍干制劑成品的水分、pH值、滲透壓摩爾濃度、蛋白含量、純度、質譜分子量、質量肽譜分析、宿主菌蛋白殘留、外源性 DNA殘留、細菌內毒素含量、熱原、生物學活性等進行了檢測,各項指標均達到治療用生物制品的申報標準要求。在此基礎上,與中國食品

9、藥品檢定研究院共同草擬了融合蛋白dTMP-GH的質量標準草案。
　　4.用放射性碘標記融合蛋白 dTMP-GH,制備得到標記率為71.5%、放射純度為96.5%、比活度為0.22MBq/μl的125I-dTMP-GH。BALB/c小鼠經尾靜脈注射放射性125I標記的dTMP-GH后,于30分鐘時股骨放射性計數達到最高值,占到注射總量的10%,隨時間推移經肝、腎代謝排出體外。證實融合蛋白 dTMP-GH具有明顯骨髓偏向性分布特點。<