T淋巴細(xì)胞相關(guān)協(xié)同刺激分子在大鼠重癥肺炎發(fā)病過程中的表達(dá)和亞胺培南聯(lián)合地塞米松的干預(yù)研究.pdf

1、研究背景：
　　重癥肺炎是臨床常見的危重癥疾病，盡管近年來醫(yī)療設(shè)備水平不斷提高，在病原學(xué)診斷、抗生素治療以及生命支持等方面有極大的進(jìn)步，但是其死亡率仍高達(dá)28％～50%。目前其死亡率高的機(jī)理尚不清楚，除微生物大量繁殖導(dǎo)致的機(jī)體損害外，亦與重癥肺炎導(dǎo)致的強(qiáng)烈炎癥反應(yīng)有關(guān)。我們在前期的研究中發(fā)現(xiàn)重癥肺炎患者外周血T淋巴細(xì)胞減少，并與患者的預(yù)后有著密切的關(guān)系；這提示T淋巴細(xì)胞亦參與了重癥肺炎的發(fā)病過程。但是T細(xì)胞減少是因為T細(xì)胞在抗炎反

2、應(yīng)中大量耗竭還是免疫抑制，或是兩者兼而有之呢？這個問題目前仍然未有明確的答案。糖皮質(zhì)激素具有強(qiáng)大的抗炎作用，但其在重癥肺炎及ARDS的作用機(jī)制尚不清楚，也仍存在較大的爭議。
　　目的：
　　本研究通過建立重癥肺炎大鼠模型，比較大鼠重癥肺炎發(fā)病過程中 CD3+ T淋巴細(xì)胞計數(shù)變化及其與 T淋巴細(xì)胞相關(guān)協(xié)同刺激分子：CD28，CD152，CD95，CD178的關(guān)系，比較炎癥因子 IL-8、IL-1β、TNF-a的變化以及應(yīng)用亞胺

3、培南、亞胺培南聯(lián)合不同劑量地塞米松干預(yù)后上述觀察指標(biāo)的變化。探討重癥肺炎可能的發(fā)病機(jī)理和地塞米松治療重癥肺炎的可能機(jī)制。
　　方法：
　　1.大鼠重癥肺炎模型的建立與評估：參考既往國內(nèi)外關(guān)于成人和動物重癥肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)，我們提出大鼠重癥肺炎模型無創(chuàng)診斷標(biāo)準(zhǔn)：
　　(1)出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、呆滯等意識障礙表現(xiàn)；
　?。?)呼吸急促（可見雙側(cè)胸廓急速運動）；
　　(3)嚴(yán)重的低氧血癥，血氧飽和度<90%或動脈血氧分壓≦

4、60mmHg；
　　(4)胸部X線檢查出現(xiàn)兩肺彌漫性滲出影。
　　取25只大鼠隨機(jī)分成對照組、普通肺炎組和重癥肺炎組，其中對照組、普通肺炎組各5只，重癥肺炎組15只。通過氣管內(nèi)注射的方式，重癥肺炎組和觀察組分別接種0.35 mL不同濃度（前者為400個麥?zhǔn)蠞岫葐挝?，后者?個麥?zhǔn)蠞岫葐挝唬┑姆窝卓死撞畻U菌菌液，對照組接種相同劑量生理鹽水。動態(tài)觀察大鼠行為學(xué)變化，體溫、體重、肢端血氧飽和度(oxygen saturation,

5、SaO2)和外周血象，胸部 X線檢查等變化。對照組和普通肺炎組在術(shù)后72h處死存活大鼠，重癥肺炎組在達(dá)到預(yù)定的診斷標(biāo)準(zhǔn)后處死，留取動脈血進(jìn)行血氣分析，留取肺組織觀察病理改變。
　　2.大鼠重癥肺炎發(fā)病過程的觀察：取5只大鼠作為對照組，20只為重癥肺炎組；通過氣管內(nèi)注射的方式，重癥肺炎組接種肺炎克雷伯桿菌菌液，對照組接種相同劑量生理鹽水。每天監(jiān)測右側(cè)大腿血氧飽和度變化；監(jiān)測大鼠胸部 X光檢查變化；于注射菌液前（基礎(chǔ)值)0h、注菌后2

6、4h（24h）、造模結(jié)束（End point）時：重癥肺炎組于 SaO2<90%，對照組于注菌后72h，眼眶后靜脈叢采血。采用流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)對大鼠外周血 T淋巴細(xì)胞相關(guān)協(xié)同刺激分子CD3+、CD28+CD3+、CD152+CD3+和CD95+、CD178+T淋巴細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。采用酶聯(lián)免疫吸附法對大鼠外周血細(xì)胞因子IL-8、IL-1β、TNF-a的濃度檢測。
　　3.亞胺培南、亞胺培南聯(lián)合地塞米松對重癥肺炎大鼠的作用觀察：模型建立成

7、功后，按干預(yù)方式不同將重癥肺炎大鼠隨機(jī)分為觀察組（Observation）、亞胺培南西司他丁鈉治療組(IMP)；低劑量地塞米松（2mg/kg）+亞胺培南西司他丁鈉治療組(LDXM/IMP)、高劑量地塞米松（4mg/kg）+亞胺培南西司他丁鈉治療組(HDXM/IMP)；并于建模成功時（0h），干預(yù)1d（24h）、3d（72h）時留取外周血標(biāo)本。采用流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)對大鼠外周血 T淋巴細(xì)胞相關(guān)協(xié)同刺激分子CD3+、CD28+CD3+、CD15

8、2+CD3+和 CD95+、CD178+ T淋巴細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。采用酶聯(lián)免疫吸附法對大鼠外周血細(xì)胞因子 IL-8、 IL-1β、TNF-a的濃度檢測。干預(yù)結(jié)束后，統(tǒng)計各組大鼠第7d、14d、28d的存活率情況。
　　結(jié)果：
　　1.大鼠重癥肺炎模型評估
　　1.1大鼠行為學(xué)變化：與對照組和普通肺炎組相比，重癥肺炎組大鼠出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍，呆滯等神智變化；鼻腔和眼眶出現(xiàn)分泌物，呼吸急促,四肢及陰囊部位出現(xiàn)紫紺,尿量、糞便減少，體

9、重明顯減輕。
　　1.2普通肺炎組和重癥肺炎組注菌后白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞計數(shù)、中性粒細(xì)胞百分?jǐn)?shù)逐漸升高，尤以重癥肺炎組變化明顯；普通肺炎組、重癥肺炎組同一時間點分別和對照組比較，均有顯著性差異，P<0.05；普通肺炎組和重癥肺炎組組間、相同時間點比較均有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05。
　　1.3血氣分析結(jié)果中，動脈血氧飽和度、動脈血氧分壓和二氧化碳分壓普通肺炎組和對照組比較，無統(tǒng)計學(xué)意義，P>0.05。與對照組和普通肺炎組相比，重

10、癥肺炎組動脈血氧飽和度、動脈血氧分壓和二氧化碳分壓下降明顯，比較有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05。其中，動脈血氧飽和度<90%，動脈血氧分壓<60 mmHg。1.4血氧飽和度儀讀數(shù)和動脈血氣分析中血氧飽和度值呈線性趨勢。Pearson相關(guān)系數(shù) r=0.977，P<0.01，具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　1.5對照組大鼠胸片無明顯異常，見雙肺肺紋理清晰，無增粗，未見實變影，未見浸潤陰影，雙側(cè)肺門清晰，雙側(cè)肋隔角銳利，雙側(cè)膈面光滑低平；普通肺

11、炎組大鼠雙肺透亮度減低，肺紋理稍粗亂。雙肺散在少量小斑片影，邊界稍模糊；重癥肺炎組大鼠見雙肺透亮度劇降，雙下肺可見散在斑片狀模糊影，整個肺野為“大白肺”。
　　1.6肺組織大體及其評分：對照組雙側(cè)肺組織表面光滑，顏色粉紅，無出血點，無浸潤灶，質(zhì)地軟嫩，彈性良好；普通肺炎組大部分肺組織光滑，偶見小片實變灶，包膜有充血，未見化膿灶；重癥肺炎組雙側(cè)肺組織不同肺葉均出現(xiàn)散在的出血點，肺包膜下充血明顯，肺組織呈暗紅色，有大片實變灶，甚至可見

12、化膿灶，肺組織彈性差，觸摸之有實質(zhì)感；肺組織大體評分：對照組大鼠沒有大鼠肺組織達(dá)到3分及其以上；普通肺炎組大鼠肺組織評分每只僅有個肺葉達(dá)到3分及其以上改變；而重癥肺炎組大鼠多個肺葉達(dá)到3分及其以上改變。
　　1.7肺組織病理切片 HE染色：鏡下見對照組大鼠組織形態(tài)正常，肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔內(nèi)無炎性滲出物浸潤，肺泡間質(zhì)無充血，水腫；普通肺炎組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)不一，肺泡間隔增寬、斷裂，肺泡間隔內(nèi)血管充血，可見紅細(xì)胞和炎癥細(xì)胞浸潤；重癥肺炎

13、組大鼠僅見少量完整肺泡，余肺泡結(jié)構(gòu)破壞，腔內(nèi)見漿液性滲出物，少量紅細(xì)胞，大量中性粒細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞浸潤，甚至肺泡腔完全實變。
　　2．重癥肺炎發(fā)病過程中各指標(biāo)比較結(jié)果
　　2.10h時各項觀察指標(biāo)重癥肺炎組和對照組之間比較無差異，P>0.05；對照組各項觀察指標(biāo)不同時間點比較無明顯差異，P>0.05。
　　2.2重癥肺炎組CD3+T淋巴細(xì)胞計數(shù)、CD28+CD3+/CD3+在24h時增多，在實驗結(jié)束時減少，不同時間點

14、組內(nèi)比較、同一時間點與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05。
　　2.3 CD152+CD3+/CD3+、CD95+、CD178+T淋巴細(xì)胞計數(shù)在24h時減少，在實驗結(jié)束時增多，不同時間點組內(nèi)比較、同一時間點與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05。
　　2.4重癥肺炎組大鼠IL-8、IL-1β、TNF-a血清濃度逐漸升高，不同時間點組內(nèi)比較、同一時間點與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05。
　　3亞胺培南、亞胺培南聯(lián)

15、合不同劑量地塞米松對重癥肺炎大鼠干預(yù)后比較
　　3.1干預(yù)前后，對照組各項觀察指標(biāo)不同時間點比較無明顯差異，P>0.05；干預(yù)前，各干預(yù)組各觀察指標(biāo)比較，無明顯差異，P>0.05。
　　3.2經(jīng)過干預(yù)后，觀察組各細(xì)胞因子持續(xù)升高，不同時間點比較有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05。與觀察組相比，余各干預(yù)組細(xì)胞因子 IL-8、IL-1β、TNF-a血清濃度逐漸下降，以HDXM/IMP組較明顯；IMP組0h與24h比較，無明顯差異，P>0

16、.05。與IMP組相比，24h時LDXM/IMP組和HDXM/IMP組各炎癥因子濃度無明顯差異,P>0.05；各干預(yù)組72h時、組內(nèi)不同時間點比較有統(tǒng)計學(xué)差異，P<0.05。
　　3.3經(jīng)過干預(yù)后，觀察組 CD3+ T淋巴細(xì)胞計數(shù)，CD28+CD3+/CD3+持續(xù)下降，CD152+CD3+/CD3持續(xù)升高，不同時間點比較有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05。與觀察組相比，余各干預(yù)組 CD3+ T淋巴細(xì)胞計數(shù)、CD28+CD3+/CD3+逐漸

17、升高，而CD152+CD3+/CD3則逐漸下降，以 HDXM/IMP組較明顯；IMP組和 LDXM/IMP組同一時間點 CD3+ T淋巴細(xì)胞計數(shù)比較，無明顯差異，P>0.05；余各干預(yù)組上述三個指標(biāo)同一時間點、組內(nèi)不同時間點比較有統(tǒng)計學(xué)差異，P<0.05。
　　3.4經(jīng)過干預(yù)后，觀察組CD95+、CD178+ T淋巴細(xì)胞計數(shù)持續(xù)升高，不同時間點比較，有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05。與觀察組相比，各干預(yù)組CD95+、CD178+ T淋巴

18、細(xì)胞計數(shù)較觀察組下降，同一時間點比較有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05；IMP組各時間點比較無統(tǒng)計學(xué)意義，P>0.05；LDXM/IMP和 HDXM/IMP組不同時間點比較有明顯差異 P<0.05。
　　3.5CD3+T淋巴細(xì)胞計數(shù)和CD28+CD3+/CD3+成正相關(guān)、和CD152+CD3+/CD3+成負(fù)相關(guān)，Pearson相關(guān)系數(shù)分別為0.925和﹣0.802，P<0.01，具有統(tǒng)計學(xué)意義。CD3+T淋巴細(xì)胞計數(shù)和CD95+成負(fù)相關(guān)、

19、和CD178+成負(fù)相關(guān)Pearson相關(guān)系數(shù)分別為﹣0.834，﹣0.799，P<0.01，具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　3.6存活率比較：各干預(yù)組大鼠7d存活率比較，為 Observation　　結(jié)論：
　　1．根據(jù)預(yù)設(shè)定的重癥肺炎無創(chuàng)診斷標(biāo)準(zhǔn)于氣管內(nèi)注射高濃度