超聲微泡載體系統(tǒng)促進(jìn)RNAi沉默Survivin基因的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景:
　　肝細(xì)胞癌是一種預(yù)后較差的致命癌癥,其發(fā)病率和死亡率年年攀升。肝癌治療有效方法的研究一直沒有取得顯著進(jìn)展?；蛑委熥鳛楦伟┲委熝芯款I(lǐng)域的重點(diǎn),受到國內(nèi)外的關(guān)注。
　　Survivin基因特異性過表達(dá)于大多數(shù)腫瘤,與腫瘤細(xì)胞的分化增殖及浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān),被認(rèn)為是理想的抗癌治療靶點(diǎn)。靶向抑制survivin基因表達(dá)可以減弱腫瘤細(xì)胞的抗凋亡能力,發(fā)揮抗癌功效。
　　RNAi技術(shù)是進(jìn)行基因治療的新工具之一,可以高效阻

2、斷體內(nèi)特定基因表達(dá),誘導(dǎo)細(xì)胞增殖過程中的基因沉默效應(yīng),具有低毒性。siRNA和shRNA是RNAi技術(shù)中常用的效應(yīng)片段。siRNA的沉默效應(yīng)是瞬時(shí)的,而shRNA與基因載體結(jié)合后,可以實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,導(dǎo)致靶基因mRNA分解,達(dá)到持續(xù)抑制靶基因的理想治療效果。但是,如何將外源基因高效的導(dǎo)入靶細(xì)胞內(nèi)是亟待改善的關(guān)鍵技術(shù)之一。
　　超聲介導(dǎo)微泡破裂技術(shù)(ultrasound-targeted microbubble destruction

3、,UTMD)近年來發(fā)展迅速,是進(jìn)行基因治療的一種新方法。它通過產(chǎn)生聲孔效應(yīng),一過性升高細(xì)胞或微血管的通透性,從而提高細(xì)胞攝取基因的能力。但是,該方法存在載體功能的不足,即微泡攜帶基因量未能達(dá)到理想值,如將其用于治療,需要增大造影劑用量。因此如何提高超聲微泡的載基因量是目前亟待解決的問題。
　　目的:
　　1.初步優(yōu)化肝癌細(xì)胞HepG2轉(zhuǎn)染相關(guān)聲學(xué)參數(shù);
　　2.利用正負(fù)電荷吸引的原理,構(gòu)建超聲微泡聯(lián)合脂質(zhì)體載體系統(tǒng),運(yùn)

4、載shRNA質(zhì)粒對(duì)survivin基因進(jìn)行靶向抑制;
　　3.比較該載體系統(tǒng)與基因轉(zhuǎn)染傳統(tǒng)方法的轉(zhuǎn)染效率、細(xì)胞活力和蛋白水平抑制率。材料和方法:
　　1.主要實(shí)驗(yàn)材料:
　　實(shí)驗(yàn)儀器:Acusonic 1MHz超聲治療儀、FACS Calibur流式檢測儀、Nanodrop1000分光光度儀、倒置熒光顯微鏡、PARADICM多功能讀板儀、IS4000MM凝膠成像分析系統(tǒng)、Xcell Sure Lock Mini-Gel

5、電泳槽、Xcell II blot module、恒壓電泳儀EPS301。
　　實(shí)驗(yàn)材料:脂氟顯超聲微泡造影劑、HepG2細(xì)胞、去內(nèi)毒素質(zhì)粒大量抽提試劑盒、DMEM高糖型培養(yǎng)基、胎牛血清FBS、脂質(zhì)體Lipofectamine2000、pcDNA6.2-EmGFP質(zhì)粒、shRNA重組質(zhì)粒、MOPSSDSbufferkit、臺(tái)盼藍(lán)染色試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、CCK-8試劑盒、ab11304鼠抗人t

6、ubulin單克隆抗體、ab93274鼠抗人survivin單克隆抗體、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG。
　　2.實(shí)驗(yàn)方法:
　　⑴將HepG2細(xì)胞交叉間隔接種于24孔板,待其生長至一定密度時(shí),添加脂氟顯微泡和GFP質(zhì)粒到各組細(xì)胞中。根據(jù)3個(gè)優(yōu)化聲學(xué)參數(shù)分為三個(gè)組:超聲強(qiáng)度梯度組(A組),分為A1~A5亞組,分別是0.4W/cm2、0.8W/cm2、1.2W/cm2、1.6W/cm2和2.0W/cm2;占空比梯度組(B組),分為

7、B1~B3亞組,分別是10％、20%和50%;時(shí)間組(C組),分為C1~C3亞組,分別是30s,90s,180s。在輻照24h后,分析各組運(yùn)載基因的效率及各自對(duì)細(xì)胞活力的影響:用熒光顯微鏡定性觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況,流式細(xì)胞術(shù)定量檢測轉(zhuǎn)染率,和臺(tái)盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞死亡率。
　　⑵構(gòu)建1對(duì)GFP標(biāo)記的survivin基因shRNA質(zhì)粒,分別為P(+)和P(-)。將HepG2細(xì)胞交叉間隔接種于24孔板中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。加入P(+)的各組分別

8、為:空白對(duì)照組(A組)、單純超聲組(B組)、脂質(zhì)體2000組(C組)和超聲+微泡組(D組)、超聲+微泡+脂質(zhì)體2000組(E組);加入P(-)的為陰性對(duì)照組(F組),其轉(zhuǎn)染條件與E組相同。觀察各組的基因轉(zhuǎn)染率和細(xì)胞存活率:利用熒光顯微鏡及流式細(xì)胞術(shù)比較基因運(yùn)送效率,CCK-8檢測細(xì)胞活力,并運(yùn)用western blot檢測各組survivin蛋白的抑制水平。
　　結(jié)果:
　　1.超聲強(qiáng)度的增加可以提高基因轉(zhuǎn)染率,但是在超過一

9、定強(qiáng)度后,由于細(xì)胞活力受到影響,死亡率隨之增加,轉(zhuǎn)染效率會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)下降。本研究發(fā)現(xiàn),采用1.2W/cm2的超聲強(qiáng)度轉(zhuǎn)染HepG2時(shí),轉(zhuǎn)染率和死亡率優(yōu)于其余聲強(qiáng)組;
　　2.隨著占空比的增加,轉(zhuǎn)染效率的變化趨勢也是先上升后下降。采用20%的占空比轉(zhuǎn)染HepG2時(shí),轉(zhuǎn)染率和死亡率優(yōu)于其余占空比組;
　　3.輻照時(shí)間也是影響細(xì)胞轉(zhuǎn)染的一個(gè)重要因素。在一定范圍內(nèi)增加時(shí)間,可以提高轉(zhuǎn)染效率,但當(dāng)超過90s后繼續(xù)增加時(shí)間,對(duì)于轉(zhuǎn)染率和細(xì)

10、胞死亡率的影響無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);
　　4.與單純脂質(zhì)體組相比,聯(lián)合運(yùn)用超聲微泡與脂質(zhì)體,可以在不增加細(xì)胞死亡數(shù)量的前提下,得到更高的轉(zhuǎn)染效率,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與超聲微泡組相比,聯(lián)合運(yùn)用超聲微泡與脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率也高出很多,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);
　　5.脂氟顯微泡對(duì)轉(zhuǎn)染效率的提升起到了重要作用,不添加微泡時(shí)轉(zhuǎn)染效果會(huì)有大幅度下降。超聲微泡組轉(zhuǎn)染效率明顯高于單純超聲組,差異具有

11、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);
　　6.Wester nblot結(jié)果顯示,與空白對(duì)照和陰性對(duì)照相比,各組survivin蛋白表達(dá)水平均出現(xiàn)不同程度的下調(diào)(P<0.05);其中超聲微泡聯(lián)合脂質(zhì)體組survivin蛋白表達(dá)下調(diào)比率為(92.82±2.69)%,明顯高于其余各組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說明目的shRNA片段具有抑制survivin基因表達(dá)的效果,也從蛋白水平進(jìn)一步說明,運(yùn)用超聲微泡聯(lián)合脂質(zhì)體的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染,可以

12、得到更好的基因沉默效果。
　　結(jié)論:
　　1.超聲輻照微泡是一種介導(dǎo)基因體外轉(zhuǎn)染的有效方法,優(yōu)化參數(shù)將有利于促進(jìn)基因轉(zhuǎn)染,得到較高的轉(zhuǎn)染率,較低細(xì)胞死亡率。超聲強(qiáng)度1.2W/cm2,占空比20%,輻照時(shí)間90s,分別為各亞組的相對(duì)最優(yōu)條件,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);
　　2.利用正負(fù)電荷吸引法構(gòu)建超聲微泡聯(lián)合脂質(zhì)體載體系統(tǒng),運(yùn)載shRNA質(zhì)粒對(duì)肝癌細(xì)胞survivin基因進(jìn)行靶向抑制,可取得理想抗癌效果,其轉(zhuǎn)染效