與鴨子黑色和白色羽毛色素沉著關(guān)聯(lián)的microRNA的分析鑒定.pdf

1、基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的一個主要機制是通過microRNA(miRNA)實現(xiàn)的。單個的miRNA可以在多種生物學過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，如細胞增殖和分化、凋亡和癌變。然而，由哪些特定miRNA可能調(diào)節(jié)羽毛色素沉著尤其是黑色素生成的機制仍然在很大程度上難以捉摸。因此，本研究旨在比較研究鴨黑色背羽和黑白色背羽二者黑色羽球的miRNA表達與鴨白色背羽和黑白色背羽二者白色羽球的miRNA表達，這些鴨分別是Cui Hei鴨、改鴨、純系連城鴨和一個改鴨-

2、連城鴨的F2群體。我們運用了Solexa測序、生物信息學和實驗方法初步篩選了與鴨子羽毛色素沉著相關(guān)的miRNA。主要結(jié)果如下:
　　(1)利用MiRDeep2軟件鑒定了129個miRNA，其中121個與已知的雞的miRNA相近，8個為新的miRNA。另外，使用DEGseq軟件還在這兩種組織中鑒定出了五個顯著差異表達的miRNA，即miR-204-5p、miR-204-3p、miR-144-3p、miR-2188-3p和miR-13

3、0a-5p。值得注意的是，miR-204最主要在黑色羽球中表達。
　　(2)為了進一步驗證測序數(shù)據(jù)，完成了10個序列已鑒定的miRNA的莖環(huán)qPCR實驗。三個miRNA（miR-204-5p、miR-30e-1-5p和miR-10b-1-5p）在黑色羽球中顯著差異表達，差異結(jié)果分別為miR-204-5p(P＜0.05)、miR-30e-1-5p(P＜0.01)和miR-10b-1-5p(P＜0.01)，而對黑色羽球和白色羽球的比較

4、發(fā)現(xiàn)miR-27-3p在白色羽球中顯著差異表達(P＜0.05)。其余六個miRNA雖然顯示出測序結(jié)果的表達模式，但并沒有顯著差異表達。
　　(3)另外，為了探索miR-204-5p的時間表達模式，通過莖環(huán)qPCR，我們在九個正常鴨組織，即心臟、肝臟、脾臟、腿部肌肉、肺、腎、皮膚、黑色羽球和白色羽球通過莖環(huán)qPCR進行了組織表達譜分析。結(jié)果表明miR-204-5p在黑色羽球中的表達顯著高于白色羽球和其他七個組織。
　　(4)此

5、外，利用靶標基因鑒定、KEGG通路和GO富集分析發(fā)現(xiàn)了潛在的靶mRNA和通路?？傆嬙邙喼邪l(fā)現(xiàn)了2324個miRNA-mRNA互作位點，其中2076個已注釋并有官方名稱。黑色素生成通路確定位于已認定的具有12個重要基因的信號通路中，因此推測這些miRNA在羽毛色素沉著中可能會發(fā)揮作用。
　　(5)同時使用qPCR實施了五個靶基因在黑色素生成通路中的表達分析。qPCR的結(jié)果表明這些基因在黑色羽球中高表達。
　　(6)我們?nèi)诤狭薽

6、iR-27-3p mimics和鴨野生型或MITF基因突變的3'非編碼區(qū)，MITF基因突變的3'非編碼區(qū)是利用XhoⅠ和NotⅠ兩種酶克隆到psiCHECK-2雙熒光素酶報告載體中，然后將其導入BHK細胞驗證miR-27-3p是否能夠與推測的MITFmRNA3'UTR位點結(jié)合。隨后進行了雙熒光素酶試驗和Western blot實驗。我們發(fā)現(xiàn)當miR-27與MITF的3'UTR（野生型）共轉(zhuǎn)染時，雙熒光素酶的活性顯著降低。Western