正畸扭轉(zhuǎn)力作用下成人牙周膜組織的基因表達(dá)分析研究.pdf

1、目前，在臨床正畸門診患者中，有越來(lái)越多的成人患者希望得到牙齒的正畸治療，但是成人已經(jīng)停止發(fā)育，其對(duì)矯治力的組織反應(yīng)變慢;而且成人的牙槽骨有吸收，牙周狀況往往較差，或多或少都存在著牙周病癥狀，所以成人尤其應(yīng)關(guān)注其牙周組織對(duì)正畸力的反應(yīng)。
　　成人和青少年的牙周膜組織存在著組織上以及對(duì)生物力反應(yīng)上的差異，而成人牙齒矯治更為復(fù)雜，成人的牙齒矯治初始遲緩，而當(dāng)開始移動(dòng)后則與青少年的移動(dòng)速度相同。成人牙周狀況往往較差，或多或少都存在著牙周病

2、癥狀，通過(guò)基因芯片在分子水平上比較成人牙周膜組織受力前后基因表達(dá)的差異，尋找其牙周膜組織受力前后的差異基因及其生物學(xué)通路，以統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，進(jìn)行計(jì)算機(jī)編程處理數(shù)據(jù)，篩選出關(guān)鍵性差異表達(dá)的基因，以更好地理解應(yīng)力環(huán)境中牙周膜的力學(xué)-生物學(xué)行為變化機(jī)制。
　　第一部分：扭轉(zhuǎn)力作用下成人牙周膜組織基因的差異表達(dá)
　　目的:為了在分子基礎(chǔ)上闡明機(jī)械應(yīng)力調(diào)節(jié)牙周膜組織的功能，通過(guò)基因芯片技術(shù)比較成人牙周膜組織受到扭轉(zhuǎn)力前后基因表達(dá)的差異，尋

3、找其牙周膜組織受力前后表達(dá)出現(xiàn)變化的基因，篩選出統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著差異表達(dá)的基因及其生物學(xué)通路，為臨床上成人正畸治療提供參考。
　　方法:隨機(jī)選取矯治設(shè)計(jì)為拔除四個(gè)第一前磨牙的成人患者16例（8例實(shí)驗(yàn)組，8例對(duì)照組），其中女性10例，男性6例，年齡在20-26歲。每位患者上頜第一雙尖牙采用6盎司正畸扭轉(zhuǎn)力值進(jìn)行交互牽引，加力4周后時(shí)制取牙周膜組織標(biāo)本。對(duì)照組拔牙后，分別于同組相同時(shí)間內(nèi)制取牙周膜組織標(biāo)本，然后提取牙周膜組織的總RNA，制

4、作牙周膜組織的Affymetrix Human U133 plus2.0基因芯片。通過(guò)對(duì)基因芯片數(shù)據(jù)的系統(tǒng)處理與統(tǒng)計(jì)，得到差異基因及關(guān)鍵性差異基因，應(yīng)用DAVID軟件對(duì)差異基因進(jìn)行GO功能注釋及生物學(xué)通路分析。通過(guò)STRING在線數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)關(guān)鍵性差異基因進(jìn)行分析，得到關(guān)鍵性差異基因編碼蛋白間的相互作用關(guān)系。
　　結(jié)果:通過(guò)比較，最后得到了212對(duì)差異模塊。在這212對(duì)差異模塊中，有50對(duì)差異模塊的基因組成完全相同。在這212對(duì)差異模

5、塊中，共包含基因727個(gè)。其中，對(duì)照組共計(jì)699個(gè)基因，處理組中共計(jì)697個(gè)基因;二者共有基因669個(gè)。
　　利用sam法，取Delta=1，對(duì)本實(shí)驗(yàn)的對(duì)照組和處理組的基因芯片信息進(jìn)行分析后共得到343個(gè)差異基因，其中倍數(shù)變化十倍以上的基因?yàn)镸IR205HG、SOX、MME、TSTD1、NHLH、ARHGEF、SYTL1、LINC00537。然后，取差異模塊基因與差異基因的交集，最后共得到10個(gè)關(guān)鍵性差異基因:ITGA7、ITGA

6、11、PSMB5、PSMD13、GPX、SEC13、SEC61G、CKAP5、CENPO、GTF2F2。
　　1.差異模塊的GO功能注釋及KEGG通路分析
　　分別對(duì)212對(duì)差異模塊中對(duì)照組和處理組中的基因進(jìn)行富集分析(包括KEGG、GOBP、GOCC、GOMF)。比較兩者中基因富集通路、生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能有無(wú)區(qū)別。
　　(1)差異模塊的模塊相關(guān)密度比較
　　分別取出差異模塊中處理組與對(duì)照組模塊相關(guān)密

7、度之差大于0和小于0的模塊對(duì)（見(jiàn)表9，表10），對(duì)這些模塊中的基因進(jìn)行富集分析后結(jié)果為(見(jiàn)表11-14):
　　①相關(guān)密度增大的模塊大部分是蛋白酶體復(fù)合物和細(xì)胞胞液等細(xì)胞組分;而相關(guān)密度減小的模塊則主要為細(xì)胞核質(zhì)、小的核糖核蛋白復(fù)合物、整合素復(fù)合物、剪接體、和細(xì)胞膜等細(xì)胞組分。
　?、谙嚓P(guān)密度增大的模塊主要為蘇氨酸內(nèi)肽酶活性、蛋白激酶活性、腺嘌呤核苷酸結(jié)合和趨化因子受體活性等分子功能;而相關(guān)密度減小的模塊則主要為翻譯起始因子

8、活性、血紅素氧化還原酶活性、核糖核酸聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄介體活性等分子功能。
　?、巯嚓P(guān)密度增大的模塊主要為有絲分裂細(xì)胞周期、泛素蛋白連接酶活性的調(diào)節(jié)以及蛋白質(zhì)調(diào)控的修飾過(guò)程等生物學(xué)過(guò)程;而相關(guān)密度減小的模塊則主要為細(xì)胞對(duì)激素刺激的反應(yīng)、mRNA剪接體的剪接功能以及谷胱甘肽代謝過(guò)程等生物學(xué)過(guò)程。
　?、芟嚓P(guān)密度增大的模塊主要集中在蛋白酶體、細(xì)胞周期、NOD樣受體信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及細(xì)胞凋亡等生物學(xué)通路;而相關(guān)密度減小的

9、模塊則主要集中在黏著斑、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、趨化因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、谷胱甘肽代謝等生物學(xué)通路。
　　(2)差異模塊中基因組成比較
　　分別對(duì)每一對(duì)差異模塊中對(duì)照組和處理組的基因組成進(jìn)行比較，找出相對(duì)于對(duì)照組來(lái)說(shuō)，處理組中的模塊內(nèi)減少和增加的基因。同時(shí)對(duì)這些基因在這些差異模塊中缺失和增加的次數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。這些頻繁增加和缺失的基因可能與扭轉(zhuǎn)力的加載是密切相關(guān)的。
　　通過(guò)比較分析，在這212對(duì)差異模塊中，有77個(gè)基因

10、是二者中共有的。其中處理組共缺失基因137個(gè)(見(jiàn)表15)，新增加基因126個(gè)(見(jiàn)表16)，對(duì)這些基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析（見(jiàn)表17-20）。
　　①差異模塊中增加和減少的基因均主要為蛋白酶體復(fù)合物和細(xì)胞胞液和整合素復(fù)合物等細(xì)胞組分。
　　②差異模塊中增加的基因主要為蘇氨酸型酶活性、蘇氨酸內(nèi)肽酶活性、肽酶活性等分子功能;而差異模塊中減少的基因則主要為為蘇氨酸內(nèi)肽酶、蛋白結(jié)合、激酶結(jié)合和蛋白激酶結(jié)合等分子功能。
　　

11、③差異模塊中增加的基因主要為蛋白泛素化的負(fù)調(diào)控、細(xì)胞蛋白代謝過(guò)程的正調(diào)節(jié)以及蛋白質(zhì)修飾過(guò)程的負(fù)調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程;而差異模塊中減少的基因則主要為蛋白泛素化的負(fù)調(diào)控、連接酶活性的負(fù)調(diào)節(jié)以及蛋白質(zhì)修飾過(guò)程的負(fù)調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程。
　?、懿町惸K中增加和減少的基因均主要集中在蛋白酶體、黏著斑、以及細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用等生物學(xué)通路。
　　2.差異基因的GO功能注釋及KEGG通路分析
　　使用DAVID分析工具獲取343個(gè)差異基因

12、的生物學(xué)通路分析結(jié)果(見(jiàn)表21，表22)。
　　①差異基因主要為細(xì)胞質(zhì)膜部分、細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)和膠原蛋白等細(xì)胞組分。
　　②差異基因主要為整合素結(jié)合、細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分、氧化還原酶活性、細(xì)胞粘附分子結(jié)合以及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性等分子功能。
　?、鄄町惢蛑饕獮榧?xì)胞外基質(zhì)組織、膠原蛋白的生物合成過(guò)程以及血管發(fā)育等生物學(xué)過(guò)程。
　　④差異基因主要集中在谷胱甘肽代謝以及細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用等生物學(xué)通路。
　　結(jié)

13、論:1.在相關(guān)密度增大和相關(guān)密度減小的差異模塊中，差異基因均參與了趨化因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，牙周膜細(xì)胞由此產(chǎn)生了相應(yīng)的免疫反應(yīng)和趨化反應(yīng)。
　　2.正畸扭轉(zhuǎn)力施加一個(gè)月后，可以引起成人牙周膜組織的炎癥性反應(yīng)，成人的牙周組織可能出現(xiàn)牙周炎前期癥狀，所以成人尤其應(yīng)關(guān)注其牙周組織對(duì)正畸力的反應(yīng)。
　　3.相關(guān)密度增大的模塊中差異基因生物學(xué)通路主要是與蛋白降解有關(guān)，并與細(xì)胞周期調(diào)控、凋亡和炎癥應(yīng)激免疫反應(yīng)有關(guān)。
　　4.相關(guān)密度減

14、小的模塊中差異基因生物學(xué)通路主要是與細(xì)胞分化及礦化有關(guān)，并與免疫系統(tǒng)功能調(diào)節(jié)、組織修復(fù)和骨代謝反應(yīng)有關(guān)。
　　5.全部差異基因的富集生物學(xué)通路只集中在兩個(gè)方面:谷胱甘肽代謝以及細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用兩個(gè)生物學(xué)通路上。在這十個(gè)關(guān)鍵性差異基因中與這兩個(gè)基因生物學(xué)通路有關(guān)的分別是:GPX4（磷脂氫谷胱甘肽過(guò)氧化物酶）表達(dá)在谷胱甘肽的基因生物學(xué)通路中;SEC13（SEC13相關(guān)蛋白）、CKAP5（細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白5）、CENPO（著絲粒蛋

15、白O）以及GTF2F2（轉(zhuǎn)錄起始因子ⅡFβ亞基）表達(dá)在細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用的基因生物學(xué)通路上。
　　第二部分：成人正畸扭轉(zhuǎn)力作用下牙周膜關(guān)鍵性差異基因的表達(dá)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)
　　目的:使用半定量反轉(zhuǎn)錄PCR(SqRT-PCR)方法，結(jié)合基因芯片的檢測(cè)數(shù)據(jù)，對(duì)之前基因芯片研究分析得到的十個(gè)關(guān)鍵性差異基因進(jìn)行驗(yàn)證，從而確定基因芯片分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。
　　方法:選取了與芯片分析相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)本，所選患者共4名，其中2名女性，2名男性

16、，年齡為20-26歲。對(duì)牙周膜組織進(jìn)行RNA的提取與cDNA合成，以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最后用凝膠成像系統(tǒng)Quantity One軟件進(jìn)行分析，結(jié)果以目的基因與β-actin條帶的相對(duì)含量表示。
　　結(jié)果:差異基因SEC61G（蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Sec61γ亞基）基因在電泳結(jié)果圖中未見(jiàn)顯示，其余差異基因則均有明顯的表達(dá)。經(jīng)對(duì)其余九個(gè)關(guān)鍵性差異基因進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后發(fā)現(xiàn):差異基因ITGA11、PSMB5、PSMD13、GP

17、X4、SEC13、CKAP5、GTF2F2，差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01);差異基因ITGA7、CENPO，其統(tǒng)計(jì)學(xué)差別結(jié)果為p＜0.05。
　　結(jié)論:半定量反轉(zhuǎn)錄-PCR的驗(yàn)證結(jié)果與之前基因芯片分析結(jié)果完全相符。在正畸扭轉(zhuǎn)力作用下，牙周膜組織中的差異基因ITGA11、PSMB5、PSMD13、GPX4、SEC13、CKAP5、GTF2F2在第一個(gè)月的牙齒矯治中發(fā)揮著顯著的作用;而差異基因ITGA7、CENPO在第一個(gè)月