正畸扭轉(zhuǎn)力作用下成人牙周膜組織的基因表達分析研究.pdf

1、目前，在臨床正畸門診患者中，有越來越多的成人患者希望得到牙齒的正畸治療，但是成人已經(jīng)停止發(fā)育，其對矯治力的組織反應變慢;而且成人的牙槽骨有吸收，牙周狀況往往較差，或多或少都存在著牙周病癥狀，所以成人尤其應關注其牙周組織對正畸力的反應。
　　成人和青少年的牙周膜組織存在著組織上以及對生物力反應上的差異，而成人牙齒矯治更為復雜，成人的牙齒矯治初始遲緩，而當開始移動后則與青少年的移動速度相同。成人牙周狀況往往較差，或多或少都存在著牙周病

2、癥狀，通過基因芯片在分子水平上比較成人牙周膜組織受力前后基因表達的差異，尋找其牙周膜組織受力前后的差異基因及其生物學通路，以統(tǒng)計學方法，進行計算機編程處理數(shù)據(jù)，篩選出關鍵性差異表達的基因，以更好地理解應力環(huán)境中牙周膜的力學-生物學行為變化機制。
　　第一部分：扭轉(zhuǎn)力作用下成人牙周膜組織基因的差異表達
　　目的:為了在分子基礎上闡明機械應力調(diào)節(jié)牙周膜組織的功能，通過基因芯片技術比較成人牙周膜組織受到扭轉(zhuǎn)力前后基因表達的差異，尋

3、找其牙周膜組織受力前后表達出現(xiàn)變化的基因，篩選出統(tǒng)計學上顯著差異表達的基因及其生物學通路，為臨床上成人正畸治療提供參考。
　　方法:隨機選取矯治設計為拔除四個第一前磨牙的成人患者16例（8例實驗組，8例對照組），其中女性10例，男性6例，年齡在20-26歲。每位患者上頜第一雙尖牙采用6盎司正畸扭轉(zhuǎn)力值進行交互牽引，加力4周后時制取牙周膜組織標本。對照組拔牙后，分別于同組相同時間內(nèi)制取牙周膜組織標本，然后提取牙周膜組織的總RNA，制

4、作牙周膜組織的Affymetrix Human U133 plus2.0基因芯片。通過對基因芯片數(shù)據(jù)的系統(tǒng)處理與統(tǒng)計，得到差異基因及關鍵性差異基因，應用DAVID軟件對差異基因進行GO功能注釋及生物學通路分析。通過STRING在線數(shù)據(jù)庫對關鍵性差異基因進行分析，得到關鍵性差異基因編碼蛋白間的相互作用關系。
　　結(jié)果:通過比較，最后得到了212對差異模塊。在這212對差異模塊中，有50對差異模塊的基因組成完全相同。在這212對差異模

5、塊中，共包含基因727個。其中，對照組共計699個基因，處理組中共計697個基因;二者共有基因669個。
　　利用sam法，取Delta=1，對本實驗的對照組和處理組的基因芯片信息進行分析后共得到343個差異基因，其中倍數(shù)變化十倍以上的基因為MIR205HG、SOX、MME、TSTD1、NHLH、ARHGEF、SYTL1、LINC00537。然后，取差異模塊基因與差異基因的交集，最后共得到10個關鍵性差異基因:ITGA7、ITGA

6、11、PSMB5、PSMD13、GPX、SEC13、SEC61G、CKAP5、CENPO、GTF2F2。
　　1.差異模塊的GO功能注釋及KEGG通路分析
　　分別對212對差異模塊中對照組和處理組中的基因進行富集分析(包括KEGG、GOBP、GOCC、GOMF)。比較兩者中基因富集通路、生物學過程、細胞組分和分子功能有無區(qū)別。
　　(1)差異模塊的模塊相關密度比較
　　分別取出差異模塊中處理組與對照組模塊相關密

7、度之差大于0和小于0的模塊對（見表9，表10），對這些模塊中的基因進行富集分析后結(jié)果為(見表11-14):
　　①相關密度增大的模塊大部分是蛋白酶體復合物和細胞胞液等細胞組分;而相關密度減小的模塊則主要為細胞核質(zhì)、小的核糖核蛋白復合物、整合素復合物、剪接體、和細胞膜等細胞組分。
　?、谙嚓P密度增大的模塊主要為蘇氨酸內(nèi)肽酶活性、蛋白激酶活性、腺嘌呤核苷酸結(jié)合和趨化因子受體活性等分子功能;而相關密度減小的模塊則主要為翻譯起始因子

8、活性、血紅素氧化還原酶活性、核糖核酸聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄介體活性等分子功能。
　?、巯嚓P密度增大的模塊主要為有絲分裂細胞周期、泛素蛋白連接酶活性的調(diào)節(jié)以及蛋白質(zhì)調(diào)控的修飾過程等生物學過程;而相關密度減小的模塊則主要為細胞對激素刺激的反應、mRNA剪接體的剪接功能以及谷胱甘肽代謝過程等生物學過程。
　?、芟嚓P密度增大的模塊主要集中在蛋白酶體、細胞周期、NOD樣受體信號通路、趨化因子信號轉(zhuǎn)導通路以及細胞凋亡等生物學通路;而相關密度減小的

9、模塊則主要集中在黏著斑、血管內(nèi)皮生長因子信號轉(zhuǎn)導通路、趨化因子信號轉(zhuǎn)導通路、谷胱甘肽代謝等生物學通路。
　　(2)差異模塊中基因組成比較
　　分別對每一對差異模塊中對照組和處理組的基因組成進行比較，找出相對于對照組來說，處理組中的模塊內(nèi)減少和增加的基因。同時對這些基因在這些差異模塊中缺失和增加的次數(shù)進行統(tǒng)計。這些頻繁增加和缺失的基因可能與扭轉(zhuǎn)力的加載是密切相關的。
　　通過比較分析，在這212對差異模塊中，有77個基因

10、是二者中共有的。其中處理組共缺失基因137個(見表15)，新增加基因126個(見表16)，對這些基因進行GO和KEGG富集分析（見表17-20）。
　　①差異模塊中增加和減少的基因均主要為蛋白酶體復合物和細胞胞液和整合素復合物等細胞組分。
　?、诓町惸K中增加的基因主要為蘇氨酸型酶活性、蘇氨酸內(nèi)肽酶活性、肽酶活性等分子功能;而差異模塊中減少的基因則主要為為蘇氨酸內(nèi)肽酶、蛋白結(jié)合、激酶結(jié)合和蛋白激酶結(jié)合等分子功能。
　　

11、③差異模塊中增加的基因主要為蛋白泛素化的負調(diào)控、細胞蛋白代謝過程的正調(diào)節(jié)以及蛋白質(zhì)修飾過程的負調(diào)控等生物學過程;而差異模塊中減少的基因則主要為蛋白泛素化的負調(diào)控、連接酶活性的負調(diào)節(jié)以及蛋白質(zhì)修飾過程的負調(diào)控等生物學過程。
　?、懿町惸K中增加和減少的基因均主要集中在蛋白酶體、黏著斑、以及細胞外基質(zhì)受體相互作用等生物學通路。
　　2.差異基因的GO功能注釋及KEGG通路分析
　　使用DAVID分析工具獲取343個差異基因

12、的生物學通路分析結(jié)果(見表21，表22)。
　?、俨町惢蛑饕獮榧毎|(zhì)膜部分、細胞細胞外基質(zhì)和膠原蛋白等細胞組分。
　?、诓町惢蛑饕獮檎纤亟Y(jié)合、細胞外基質(zhì)結(jié)構成分、氧化還原酶活性、細胞粘附分子結(jié)合以及谷胱甘肽過氧化物酶活性等分子功能。
　?、鄄町惢蛑饕獮榧毎饣|(zhì)組織、膠原蛋白的生物合成過程以及血管發(fā)育等生物學過程。
　　④差異基因主要集中在谷胱甘肽代謝以及細胞外基質(zhì)受體相互作用等生物學通路。
　　結(jié)

13、論:1.在相關密度增大和相關密度減小的差異模塊中，差異基因均參與了趨化因子信號轉(zhuǎn)導通路，牙周膜細胞由此產(chǎn)生了相應的免疫反應和趨化反應。
　　2.正畸扭轉(zhuǎn)力施加一個月后，可以引起成人牙周膜組織的炎癥性反應，成人的牙周組織可能出現(xiàn)牙周炎前期癥狀，所以成人尤其應關注其牙周組織對正畸力的反應。
　　3.相關密度增大的模塊中差異基因生物學通路主要是與蛋白降解有關，并與細胞周期調(diào)控、凋亡和炎癥應激免疫反應有關。
　　4.相關密度減

14、小的模塊中差異基因生物學通路主要是與細胞分化及礦化有關，并與免疫系統(tǒng)功能調(diào)節(jié)、組織修復和骨代謝反應有關。
　　5.全部差異基因的富集生物學通路只集中在兩個方面:谷胱甘肽代謝以及細胞外基質(zhì)受體相互作用兩個生物學通路上。在這十個關鍵性差異基因中與這兩個基因生物學通路有關的分別是:GPX4（磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶）表達在谷胱甘肽的基因生物學通路中;SEC13（SEC13相關蛋白）、CKAP5（細胞骨架相關蛋白5）、CENPO（著絲粒蛋

15、白O）以及GTF2F2（轉(zhuǎn)錄起始因子ⅡFβ亞基）表達在細胞外基質(zhì)受體相互作用的基因生物學通路上。
　　第二部分：成人正畸扭轉(zhuǎn)力作用下牙周膜關鍵性差異基因的表達驗證實驗
　　目的:使用半定量反轉(zhuǎn)錄PCR(SqRT-PCR)方法，結(jié)合基因芯片的檢測數(shù)據(jù)，對之前基因芯片研究分析得到的十個關鍵性差異基因進行驗證，從而確定基因芯片分析結(jié)果的準確性。
　　方法:選取了與芯片分析相應標準的標本，所選患者共4名，其中2名女性，2名男性

16、，年齡為20-26歲。對牙周膜組織進行RNA的提取與cDNA合成，以β-actin為內(nèi)參進行PCR擴增，最后用凝膠成像系統(tǒng)Quantity One軟件進行分析，結(jié)果以目的基因與β-actin條帶的相對含量表示。
　　結(jié)果:差異基因SEC61G（蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白Sec61γ亞基）基因在電泳結(jié)果圖中未見顯示，其余差異基因則均有明顯的表達。經(jīng)對其余九個關鍵性差異基因進行統(tǒng)計學分析后發(fā)現(xiàn):差異基因ITGA11、PSMB5、PSMD13、GP

17、X4、SEC13、CKAP5、GTF2F2，差異具有顯著的統(tǒng)計學意義(p＜0.01);差異基因ITGA7、CENPO，其統(tǒng)計學差別結(jié)果為p＜0.05。
　　結(jié)論:半定量反轉(zhuǎn)錄-PCR的驗證結(jié)果與之前基因芯片分析結(jié)果完全相符。在正畸扭轉(zhuǎn)力作用下，牙周膜組織中的差異基因ITGA11、PSMB5、PSMD13、GPX4、SEC13、CKAP5、GTF2F2在第一個月的牙齒矯治中發(fā)揮著顯著的作用;而差異基因ITGA7、CENPO在第一個月