P2X3受體在咬合干擾所致大鼠口頜面疼痛中的作用研究.pdf

1、本文從以下幾部分進(jìn)行論述：
　　第一部分 咬合干擾導(dǎo)致大鼠口頜面部疼痛及組織學(xué)變化的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:
　　通過單側(cè)咬合抬高建立咬合干擾動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停私庖Ш细蓴_建立后大鼠口頜面部痛閾的變化和所出現(xiàn)的組織學(xué)改變，明確咬合干擾在顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病(temporomandibular disorder，TMD)的作用，進(jìn)一步探討咬合干擾引起口頜面部疼痛的外周機(jī)制。
　　方法:
　　40只8周齡雄性Wistar大

2、鼠，隨機(jī)分為5個(gè)對(duì)照組（每組4只）與5個(gè)實(shí)驗(yàn)組（每組4只），利用在大鼠右側(cè)下頜第一磨牙上粘固鑄造冠的方法建立咬合干擾動(dòng)物模型。于建立模型后1，3，7，14，28天，用Von Frey尼龍毛測量雙側(cè)咬肌和顳下頜關(guān)節(jié)(Temporomandibular joint，TMJ)的疼痛分值，然后分批處死，每組取3只大鼠的雙側(cè)咬肌和TMJ滑膜在光鏡觀察HE染色組織學(xué)的改變，并通過免疫熒光技術(shù)檢測咬肌結(jié)蛋白表達(dá)量的改變。每組的另1只大鼠取雙側(cè)咬肌和T

3、MJ滑膜在電鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)的改變。
　　結(jié)果:
　　1.建模后，實(shí)驗(yàn)大鼠的雙側(cè)咬肌和TMJ的疼痛閾值均發(fā)生改變。痛覺過敏持續(xù)了整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，實(shí)驗(yàn)組的干擾側(cè)和非干擾側(cè)的疼痛分值在建模后各時(shí)間點(diǎn)均高于基準(zhǔn)線和對(duì)照組，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，但是干擾側(cè)與非干擾側(cè)的疼痛分值之間未見明顯差異(p＞0.05)。在實(shí)驗(yàn)組大鼠的雙側(cè)咬肌和TMJ，疼痛分值于咬合干擾模型建立后呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，建模后第

4、1天疼痛分值開始逐漸升高，TMJ在第3、7天，咬肌在第7天時(shí)達(dá)到最高峰，之后疼痛分值逐漸下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　2.實(shí)驗(yàn)組各組大鼠中，咬肌組織未見明顯的炎性細(xì)胞浸潤。光鏡下，在建模立后7、14，28天，咬肌組織小部分區(qū)域開始出現(xiàn)肌纖維排列紊亂和中央細(xì)胞核;咬肌內(nèi)結(jié)蛋白陽性區(qū)域在建模后3天開始出現(xiàn)減少且呈不規(guī)則;7天組呈點(diǎn)狀分布，部分區(qū)域出現(xiàn)結(jié)蛋白缺失現(xiàn)象，以后逐漸緩解，28天時(shí)接近對(duì)照組。電鏡下，咬肌細(xì)胞在

5、建模后3天可見核膜皺縮，染色質(zhì)不均勻，7天組出現(xiàn)肌膜模糊不清，染色質(zhì)邊集呈新月狀，線粒體及糖原增多，線粒體空泡變性等細(xì)胞凋亡初期特征，以后逐漸恢復(fù)，28天組接近正常。
　　3.實(shí)驗(yàn)組各組大鼠中，TMJ滑膜組織并未表現(xiàn)出明顯的炎性細(xì)胞浸潤。光鏡下觀察到，7、14、28天實(shí)驗(yàn)組大鼠TMJ滑膜表面出現(xiàn)褶皺，滑膜內(nèi)膜細(xì)胞增生，滑膜下間質(zhì)內(nèi)血管輕度擴(kuò)張，數(shù)目增多。電鏡下，僅在7、14、28天組大鼠雙側(cè)TMJ滑膜觀察到成纖維細(xì)胞內(nèi)分泌糖原顆粒

6、增多，巨噬細(xì)胞細(xì)胞膜內(nèi)膜不清晰。
　　結(jié)論:
　　1.實(shí)驗(yàn)性咬合干擾可以直接引起TMD的口頜面部的疼痛，可見咬合紊亂是TMD的重要病因之一。
　　2.實(shí)驗(yàn)性咬合干擾不能引起咬肌和TMJ炎癥性改變，但是可以導(dǎo)致咬肌纖維出現(xiàn)能量代謝障礙，部分細(xì)胞凋亡，結(jié)蛋白的缺失等損傷以及TMJ滑膜的微創(chuàng)傷。這些口頜面部的微損傷并不是咬合干擾引起的口頜面部疼痛的主要原因，但可以加劇口頜面部的疼痛。
　　第二部分 三叉神經(jīng)節(jié)與三叉神經(jīng)

7、脊束核尾側(cè)亞核內(nèi)P2X3受體參與咬合干擾所致大鼠口頜面疼痛的作用研究
　　目的:
　　為了進(jìn)一步探討P2X3受體在咬合干擾所致口頜面部疼痛中的作用機(jī)制，在咬合干擾動(dòng)物模型建立后，通過觀察大鼠口頜面部痛閾改變的情況以及P2X3受體在外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)變化，并探究這二者的關(guān)系，為探索臨床上TMD患者口頜面部疼痛的治療思路提供研究基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.3周齡健康雄性Wistar大鼠6只，隨機(jī)分為2組，每組

8、3只。采用熒光金(Fluoro Gold，F(xiàn)G)免疫熒光逆行示蹤的方法，檢測三叉神經(jīng)節(jié)(Trigeminalganglion，TG)中TMJ和咬肌的傳入神經(jīng)分布情況，
　　2.90只8周齡雄性Wistar大鼠，隨機(jī)分為5個(gè)對(duì)照組（每組9只）與5個(gè)實(shí)驗(yàn)組（每組9只），實(shí)驗(yàn)組建立咬合干擾動(dòng)物模型。于建立模型后1，3，7，14，28天用測量雙側(cè)咬肌和TMJ的疼痛分值，然后分批處死，取雙側(cè)TG和三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核(Subnuclei

9、caudalis，Vc)對(duì)相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測。應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法檢測P2X3受體陽性細(xì)胞率;用熒光定量PCR(real-time PCR)法檢測組織中P2X3受體mRNA的相對(duì)表達(dá)量，用Western Blot技術(shù)檢測細(xì)胞檢測組織中P2X3受體的表達(dá)。
　　3.12只8周齡雄性Wistar大鼠，隨機(jī)分為4組，每組3只，在痛閾最低的時(shí)間點(diǎn)2組分別在咬肌和TMJ注射P2X3受體拮抗劑A-317491，剩余2組注射生理鹽水，檢測注射前

10、后咬肌和TMJ疼痛分值的變化。
　　結(jié)果:
　　1.經(jīng)免疫熒光染色后在大鼠TG內(nèi)可同時(shí)觀察到FG和P2X3受體雙標(biāo)的神經(jīng)元。在TG組織內(nèi)，有14.4±2.0％的神經(jīng)元支配TMJ的傳入神經(jīng)，而18.1±2.5％的神經(jīng)元支配咬肌的傳入神經(jīng)。同時(shí)，支配TMJ的TG神經(jīng)元中有44.1±7.0％表現(xiàn)出P2X3受體免疫陽性，而支配咬肌的TG神經(jīng)元中有48.5±5.4％表現(xiàn)出P2X3受體免疫陽性。
　　2.建模后，實(shí)驗(yàn)組雙側(cè)TG組織

11、中小直徑神經(jīng)細(xì)胞的P2X3受體陽性細(xì)胞比例改變呈先升高后降低趨勢，與咬肌和TMJ疼痛分值改變類似。實(shí)驗(yàn)組雙側(cè)TG組織中小直徑神經(jīng)細(xì)胞的P2X3受體陽性細(xì)胞比例在建模后第7天到達(dá)高峰，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);而實(shí)驗(yàn)組雙側(cè)Vc組織中P2X3受體陽性細(xì)胞比例在第3天即達(dá)到高峰，并持續(xù)到第7天(p＜0.05)。
　　3.建模后在實(shí)驗(yàn)組的雙側(cè)TG組織中，P2X3受體mRNA的相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組，并在第3天時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

12、(p＜0.05)。在實(shí)驗(yàn)組雙側(cè)Vc組織中，P2X3受體mRNA的相對(duì)表達(dá)量從建模后第1天開始即顯著升高，之后逐漸降低，且在建模后的第1，3，7天與對(duì)照組相比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　4.建模后Western blot結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組雙側(cè)TG組織中P2X3受體與對(duì)照組相比未見明顯升高(p＞0.05)。從建模后3天開始，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物雙側(cè)Vc組織中P2X3受體相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組呈現(xiàn)明顯升高(p＜0.05)，7天時(shí)達(dá)到峰值

13、，之后相對(duì)表達(dá)量略有下降，但仍高于對(duì)照組。而干擾側(cè)與非干擾側(cè)之間的差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。
　　5.在注射P2X3受體拮抗劑A-317491和生理鹽水后，注射A-317491的大鼠顳下頜關(guān)節(jié)疼痛分值顯著低于注射生理鹽水組，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.P2X3受體廣泛存在于三叉神經(jīng)節(jié)及其對(duì)咬肌及TMJ的分支中， TG和Vc內(nèi)的P2X3受體參與咬合干擾所致的口頜面部疼痛傳導(dǎo)的外周