Siglec-8介導(dǎo)柴樸湯對肝郁型哮喘EOS凋亡的影響.pdf

1、目的：1、探討柴樸湯對肝郁型哮喘大鼠EOS凋亡及siglec-8的影響
　　2、探討柴樸湯對人EOS凋亡及siglec-8的影響
　　方法：1、柴樸湯對肝郁型哮喘大鼠EOS凋亡及siglec-8的影響。肝郁型大鼠模型的建立：取70只雄性SD大鼠（180g），隨機(jī)分為對照組、正常中藥組、哮喘組、哮喘治療組、肝郁哮喘組、肝郁哮喘治療組、地塞米松組。肝郁哮喘組、肝郁哮喘治療組、地塞米松組三組大鼠于第1~28天進(jìn)行慢性不可預(yù)見性應(yīng)激

2、刺激（CUMS），對照組、正常中藥組、哮喘組及哮喘治療四組則組不做任何處理。除對照組外的六組大鼠于實(shí)驗(yàn)第29天腹腔注射1ml抗原液（10mg OVA、100mg氫氧化鋁凝膠），再于實(shí)驗(yàn)第36天加強(qiáng)致敏。對照組則給予等量的生理鹽水腹腔注射。在實(shí)驗(yàn)第43天，將6組大鼠置于霧化箱中，以1％ OVA溶液霧化30 min，對照組則以生理鹽水替代。用Buxco動(dòng)物呼吸功能測定系統(tǒng)，測量各組大鼠氣道阻力。HE染色觀察氣道病理改變。支氣管灌洗液觀察氣道

3、各炎癥細(xì)胞比例。支氣管灌洗液流式細(xì)胞計(jì)數(shù)觀察 EOS凋亡情況。Western-blot及 Q-PCR檢測siglec-8表達(dá)水平。
　　2、柴樸湯對人EOS凋亡及siglec-8的影響。人EOS的提?。喝⊥庵苎?4ml，分裝于4支50ml離心管中，加入五倍體積的紅細(xì)胞裂解液。-20℃保存10min，于4℃500r離心8min。摒棄上清液，分別加入5ml2%HBS/Hanks液，混勻后收集與同一離心管4℃500r離心8min，摒棄上

4、清液，加入1ml2%HBS/Hanks和1mlFMLP，37℃水浴10min。取一支15ml離心管，按順序分別加入75%70%65%和53%的percoll分離液。緩慢加入水浴后的白細(xì)胞重懸液，4℃2400r離心20min。緩慢吸取70%percoll分離液上層的分離液。其余分離液加入3倍體積1*PBS，4℃2400r離心10min，摒棄上清液，反復(fù)三次后將分離出的EOS于10%HBS/RPMI1640中培養(yǎng)。柴樸湯制配：柴胡42g，半

5、夏36g，茯苓54g，黃芩18g，厚樸18g，大棗18g，人參1.8g，甘草12g，蘇葉12g，生姜6g。所需生藥煎煮三次，第一次1.5小時(shí)，第二、三次每次1小時(shí)，合并三次藥液后加入適量85%乙醇沉淀，去沉淀取上清液，過濾，回收乙醇，消毒濃縮，最終每毫升藥液中含生藥1.0g。含藥血清的制配：180g雄性SD大鼠10只柴樸湯灌胃，每日早晚各一次，每次4ml,連續(xù)10天。與最后一天灌胃后1h腹主動(dòng)脈取血，離心后取上層血清，56℃滅活30mi

6、n。-20℃保存?zhèn)溆?。將提取的EOS放入含5%，10%及20%的含藥血清中，于37℃培養(yǎng)箱中孵育1h后提取蛋白質(zhì)及 RNA， Western-blot及Q-PCR檢測siglec-8表達(dá)水平。
　　結(jié)果：1、肝郁模型的建立與評價(jià)，相對于對照組，肝郁模型組大鼠體重變化低于對照組，糖水消耗量低于對照組，開野活動(dòng)水平及垂直活動(dòng)次數(shù)低于對照組，強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間高于對照組，其差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　2、哮喘模型的建

7、立，相對于對照組，哮喘組與肝郁型哮喘組大鼠出現(xiàn)呼吸頻率加快、節(jié)律不齊、點(diǎn)頭樣呼吸，發(fā)紺，煩躁不安，其毛發(fā)無光澤，說明哮喘激發(fā)成功，肺功能測定哮喘組和肝郁哮喘組氣道阻力高于對照組（P<0.01）。肺組織HE染色顯示哮喘組：氣道及周圍組織可見炎性細(xì)胞浸潤，上皮細(xì)胞水腫、脫落；支氣管黏膜及平滑肌增生，部分可見平滑肌破壞斷裂。肝郁哮喘組：氣道黏膜及平滑肌嚴(yán)重增生；可見平滑肌破壞斷裂，小氣道閉塞，炎性細(xì)胞浸潤，肺泡呈擴(kuò)張態(tài)并可見滲出物。支氣管肺泡

8、灌洗液細(xì)胞分類計(jì)數(shù)炎癥細(xì)胞總數(shù)哮喘組與肝郁哮喘組分別為（78.00±6.88）×107/L、（89.5±3.69）×107/L，嗜酸性粒細(xì)胞比例（23.32±3.59）%、（30.79±4.62）%，均高于對照組（33.00±2.58）×107/L、（0.77±0.22）%（P<0.01），其中肝郁哮喘組炎癥細(xì)胞總數(shù)與嗜酸性粒細(xì)胞比例高于哮喘組（P<0.01）。肺功能測定肝郁哮喘組與哮喘組的氣道阻力均高于對照組（P<0.01），其中肝郁

9、哮喘組高于哮喘組（P<0.01）。肺組織HE染色可見哮喘組：支氣管粘膜及平滑肌增生，可見平滑肌斷裂，氣道周圍可見多種炎癥細(xì)胞浸潤，以嗜酸性粒細(xì)胞為主，上皮細(xì)胞水腫。肝郁哮喘組：部分小氣道閉塞，氣道粘膜及平滑肌增生嚴(yán)重，可見平滑肌斷裂，氣道周圍炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡呈擴(kuò)張狀態(tài)。
　　3、柴樸湯對大鼠EOS凋亡及siglec-8的影響，哮喘治療組支氣管肺泡灌洗液分類計(jì)數(shù)炎癥細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞比例分別為（43.25±3.77）×107/

10、L、（5.07±1.29）%，低于哮喘組（P<0.01），肝哮治療組及地塞米松組支氣管肺泡灌洗液炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞比例分別為（40.25±3.86）×107/L、（5.01±2.04）%，（41.50±4.65）×107/L、（5.65±2.59）%，均低于肝郁哮喘組。其中哮喘治療組、肝郁哮喘組及地塞米松組炎癥細(xì)胞總數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞比例無明顯差異，三者均高于對照組（P<0.01）。對照組、哮喘組、肝郁哮喘組、正常中藥組、哮喘治療

11、組、肝哮治療組及地塞米松組嗜酸性粒細(xì)胞凋亡率分別為（5.59±0.61）%、（4.23±0.30）%、4.10±0.43）%、（5.74±0.46）%、（15.76±0.43）%、（17.18±0.66）%、（17.42±1.28）%，其中哮喘組及肝郁哮喘組嗜酸性粒細(xì)胞凋亡率低于對照組（P<0.05），哮喘組與肝郁哮喘組嗜酸性粒細(xì)胞凋亡無明顯差異。哮喘治療組嗜酸性粒細(xì)胞凋亡率高于哮喘組（P<0.01），肝哮治療組及地塞米松組嗜酸性粒細(xì)胞

12、凋亡率高于肝哮治療組（P<0.01），哮喘治療組、肝哮治療組及地塞米松組之間無明顯差異。Siglec-8的表達(dá)中，哮喘組及肝郁哮喘組肺組織siglec-8mRNA及蛋白表達(dá)低于對照組（P<0.01），哮喘治療組siglec-8mRNA及蛋白表達(dá)高于哮喘組（P<0.01），肝哮治療組及地塞米松siglec-8mRNA及蛋白表達(dá)高于肝郁哮喘組（P<0.01）。
　　4、柴樸湯含藥血清對人嗜酸性粒細(xì)胞siglec-8的影響。5%、10%