新型娃兒藤堿衍生物NK-007在膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎和腸炎模型中作用機(jī)制研究.pdf

1、腫瘤壞死因子α（tumour necrosis factorα）作為一種內(nèi)毒素誘導(dǎo)的糖蛋白于1975年被發(fā)現(xiàn)，當(dāng)腫瘤壞死因子alpha被移植到小鼠體內(nèi)，人們發(fā)現(xiàn)它能引發(fā)腫瘤的敗血壞死。人的腫瘤壞死因子于1985年被克隆出來，而且重組的TNF-α能夠使小鼠的腫瘤敗血壞死，由于此，TNF-α與很大范圍的炎癥、感染以及惡劣條件相關(guān)，并且通過有效運(yùn)用抗TNF-α的抗體或者注射可溶性的TNF-α受體(TNFRs)能達(dá)到控制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的炎癥活性以

2、及其他炎癥疾病的目的，TNF-α在炎癥中的重要性也逐漸被人們賦予高度重視。
　　在我們已發(fā)表的文章中，我們發(fā)現(xiàn)新娃兒藤堿DCB-3503能夠抑制小鼠的關(guān)節(jié)炎發(fā)病，其中的機(jī)制是通過影響固有細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的能力。但是由于DCB-3503多方面的性能，如復(fù)雜的合成工藝和不溶于水等特性，我們合成了許多DCB-3503的衍生物，并通過一套穩(wěn)定的抗TNF-α篩選體系，篩選出NK-007在抗TNF方面有突出效果，并且NK-007在多方面的性

3、能優(yōu)于DCB3503，比如，水溶性、和簡(jiǎn)易合成過程。除此之外，由于關(guān)節(jié)炎與腸炎都是典型的TNF-α誘導(dǎo)的炎癥疾病，前期的工作也在兩種動(dòng)物模型（膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎和腸炎模型）中驗(yàn)證了NK-007抗TNF-α的體內(nèi)作用，從而減緩并抑制了小鼠關(guān)節(jié)炎或腸炎的發(fā)病進(jìn)程，我的工作主要是參與了NK-007抗炎作用機(jī)制的探究。
　　隨后我們發(fā)現(xiàn)，NK-007之所以可以抑制或減緩小鼠在關(guān)節(jié)炎模型中的發(fā)病，一方面是因?yàn)橐种屏岁P(guān)節(jié)炎發(fā)病小鼠關(guān)節(jié)局部和全身

4、引流淋巴結(jié)產(chǎn)生TNF-α的功能。同時(shí)，熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)NK-007不具有下調(diào)TNF轉(zhuǎn)錄的功能，而向細(xì)胞培養(yǎng)液中添加放線菌素D的方法驗(yàn)證了NK-007具有下調(diào)TNF-α轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性的作用，這些結(jié)果說明NK-007在轉(zhuǎn)錄后水平抑制TNF-α的表達(dá)?；谝陨蟽煞N現(xiàn)象，我們采用蛋白印跡檢測(cè)法去探究在TNF-α轉(zhuǎn)錄本穩(wěn)定性信號(hào)通路中NK-007發(fā)揮的作用，結(jié)果顯示磷酸化的p-38蛋白以及MK2在NK-007處理過的細(xì)胞中顯著低表達(dá)，TPP作為

5、TNF-α轉(zhuǎn)錄本穩(wěn)定性的負(fù)調(diào)控因子在NK-007處理過的細(xì)胞中表達(dá)明顯升高。
　　另一方面是因?yàn)镹K-007具有降低關(guān)節(jié)炎發(fā)病小鼠引流淋巴結(jié)中Th17細(xì)胞亞群的比率。為了進(jìn)一步研究Th17細(xì)胞在關(guān)節(jié)炎發(fā)病小鼠體內(nèi)減少的機(jī)制，我們對(duì)樹突狀細(xì)胞進(jìn)行NK-007預(yù)處理，結(jié)果顯示經(jīng)過NK-007處理過的樹突狀細(xì)胞中的IL-6表達(dá)明顯降低。通過這一現(xiàn)象，我們就假設(shè)NK-007通過抑制樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生IL-6的能力，進(jìn)而間接地抑制了Th17細(xì)胞

6、的分化。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，我們?cè)谌狈L-6的誘導(dǎo)Th17分化的體系中加入NK-007處理過的樹突狀細(xì)胞的上清液，然后使之與對(duì)照組相比，發(fā)現(xiàn)NK-007確實(shí)抑制Th17的分化.隨后，我們又進(jìn)一步探討了NK-007是否可以直接抑制Th17細(xì)胞的分化，我們?cè)谌鄙買L-6的誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化的體系中對(duì)其分別進(jìn)行NK-007或空白試劑處理，并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)法檢測(cè)不同處理組的Th17細(xì)胞分化情況，我們得到的結(jié)果顯示NK-007處理組誘導(dǎo)Th1

7、7細(xì)胞分化的比例顯著降低，表明NK-007具有直接抑制Th17分化的功能。
　　NK-007之所以能抑制或減緩小鼠在腸炎模型中的發(fā)病，是因?yàn)镹K-007具有通過下調(diào)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α和骨髓來源的樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α和IL-12的作用。由于NF-κB(p50/p65)是調(diào)控天然免疫和適應(yīng)性免疫中相關(guān)基因表達(dá)的主要轉(zhuǎn)錄因子，所以我們就采取western blot的方法對(duì)p65，p-p65，IκB和p-IκB的表達(dá)進(jìn)行了研究，結(jié)