也木勒白羊卵泡抑制素α亞基DNA疫苗免疫原性及RNA干擾效果初步研究.pdf

1、抑制素(INH)又稱卵泡抑制素或性腺抑制素，是一種主要由卵巢顆粒細(xì)胞和睪丸支持細(xì)胞分泌產(chǎn)生的糖蛋白質(zhì)激素，由一個(gè)α亞基和一個(gè)β亞基通過二硫鍵構(gòu)成，其中抑制素α亞基（INHα）是抑制素發(fā)揮生理功能必不可少的。抑制素主要生理功能是抑制促卵泡素(FSH)的釋放，對(duì)雌性動(dòng)物主要表現(xiàn)為調(diào)節(jié)卵泡的生成，增加成熟的優(yōu)勢(shì)卵泡數(shù)量；對(duì)雄性動(dòng)物主要表現(xiàn)為促進(jìn)精子的發(fā)生，提高睪丸的生精能力；還對(duì)雌雄動(dòng)物共同表現(xiàn)為促使性成熟提前。因此，可通過調(diào)節(jié)抑制素α亞基基

2、因在機(jī)體內(nèi)的表達(dá)量，降低體內(nèi)抑制素水平，促進(jìn)卵泡發(fā)育和精子的生成，最終提高動(dòng)物的繁殖力。
　　目前主要通過兩種途徑降低動(dòng)物體內(nèi)抑制素的水平，其一是通過對(duì)動(dòng)物進(jìn)行主動(dòng)或被動(dòng)免疫抑制素原來使得機(jī)體內(nèi)抑制素抗體含量增加，中和動(dòng)物體內(nèi)所分泌的抑制素，從而降低動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的抑制素水平；其二是通過 RNA干擾技術(shù)下調(diào)抑制素α亞基基因 mRNA水平上的表達(dá)，最終致使動(dòng)物機(jī)體內(nèi)所分泌抑制素的量相對(duì)減少，降低在動(dòng)物體內(nèi)的抑制素水平。本研究運(yùn)用了生物信

3、息學(xué)技術(shù)、基因克隆技術(shù)、蛋白質(zhì)分析技術(shù)、基因免疫技術(shù)等以新疆塔城地區(qū)也木勒白羊卵泡抑制素α亞基作為選擇基因，對(duì)目的基因主要進(jìn)行以下幾方面的研究試驗(yàn)：
　　1、也木勒白羊卵泡抑制素α亞基基因的克隆及序列分析
　　為了克隆和序列分析也木勒白羊抑制素α亞基基因，根據(jù) GenBank檢索到的 INHα亞基基因序列(GenBank號(hào)：XM_004004955.1)設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，本試驗(yàn)采集發(fā)情期也木勒白羊卵巢組織為研究對(duì)象，從中快

4、速抽提總 RNA作為模板。利用基因克隆技術(shù)和現(xiàn)代生物技術(shù)對(duì)也木勒白羊 INHαcDNA進(jìn)行克隆和測(cè)序及序列分析。測(cè)序及分析結(jié)果：也木勒白羊抑制素基因全長(zhǎng)為1109bp，其中只含有1083bp組成開放閱讀框(ORF)，其起始密碼子為 ATG，終止密碼子為 TAA，含完整的抑制素α亞基亞基序列編碼區(qū)，共編碼360個(gè)氨基酸殘基。將所得序列提交到 GenBank，獲得登錄號(hào)：KP-113678。
　　2、也木勒白羊卵泡抑制素α亞基基因真核

5、表達(dá)載體的構(gòu)建
　　對(duì)也木勒白羊抑制素α亞基基因進(jìn)行克隆和序列分析的基礎(chǔ)上，采用定向克隆技術(shù)，構(gòu)建也木勒白羊卵泡抑制素α亞基基因與綠色熒光蛋白基因融合表達(dá)載體 pEGFP- INHα，并對(duì)所構(gòu)建的真核表達(dá)載體 pEGFP-INHα，運(yùn)用菌液 PCR、雙酶切、測(cè)序、BHK-21細(xì)胞瞬轉(zhuǎn)及蛋白表達(dá)等試驗(yàn)進(jìn)行鑒定。結(jié)果：本次試驗(yàn)成功構(gòu)建了含也木勒白羊卵泡抑制素α亞基基因的綠色熒光真核表達(dá)載體(pEGFP-INHα)，并在 BHK-21細(xì)

6、胞中獲得了分泌型表達(dá)，轉(zhuǎn)染率高達(dá)70％以上。檢測(cè)到的該基因蛋白表達(dá)分子量約為40KD，該載體的構(gòu)建為抑制素基因疫苗的研制奠定了一定基礎(chǔ)。
　　3、也木勒白羊卵泡抑制素α亞基基因疫苗對(duì)家兔生殖激素的影響
　　為了初步研究構(gòu)建的也木勒白羊卵泡抑制素α亞基綠色熒光真核表達(dá)載體（pEGFP-INHα）的免疫原性，在本實(shí)驗(yàn)中根據(jù)基因免疫技術(shù)，以成功制備的抑制素重組質(zhì)粒 pEGFP-INHα為免疫原，對(duì)30只家兔進(jìn)行基因免疫試驗(yàn)，應(yīng)用酶

7、聯(lián)免疫法(ELISA)檢測(cè)抗抑制素抗體，放射免疫法(RIA)測(cè)定處理后不同時(shí)期血清中部分生殖激素水平。結(jié)果：重組質(zhì)粒 pEGFP-INHα免疫家兔后，各實(shí)驗(yàn)組抗體滴度均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，且在第2次加強(qiáng)免疫后抗體水平明顯上升。首次免疫后，促卵泡素(FSH)和雌二醇(E2)平均含量均高于對(duì)照組，且在第2次加強(qiáng)免疫階段差異顯著，但在兩次免疫前后促黃體素（LH）均無明顯變化。這些結(jié)果表明：抑制素基因免疫家兔可降低抑制素的含量，促進(jìn)

8、 FSH和 E2分泌，進(jìn)而影響動(dòng)物卵泡發(fā)育和誘導(dǎo)動(dòng)物多產(chǎn)。
　　4、也木勒白羊卵泡抑制素α亞基基因靶向 SiRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建
　　為了構(gòu)建也木勒白羊抑制素α亞基基因靶向 SiRNA真核表達(dá)載體，根據(jù)本課題上傳至 GenBank的 INHα基因序列（GenBank號(hào)：KP-113678.1）設(shè)計(jì)3個(gè)不同位點(diǎn)的干擾片段，利用 RNAi技術(shù)和實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法將3個(gè)干擾片段同時(shí)連接到同一個(gè)小 RNA專用真核表達(dá)載體中，并對(duì)其進(jìn)