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1、目的:通過比較分析和探討研究結(jié)核桿菌泛素樣蛋白(Pup)-蛋白酶體系統(tǒng)(包括 Pup基因、Mpa基因、Dop基因、PafA基因)分別在新疆地區(qū)流行的結(jié)核桿菌藥物敏感菌株(不耐藥菌株)、單純耐一線抗結(jié)核藥物(利福平、異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇)的結(jié)核桿菌臨床分離株、耐多藥的結(jié)核桿菌臨床分離株中缺失突變對(duì)其耐藥性產(chǎn)生的影響。
方法:以利用SOE-PCR技術(shù)和T載體構(gòu)建及鑒定各基因置換型缺失突變載體;利用電穿孔技術(shù)將各缺失突變載體分別
2、電轉(zhuǎn)化至不同耐藥結(jié)核桿菌菌株,并鑒定;利用刃天青顯色法快速檢測(cè)各組結(jié)核桿菌菌株最小抑菌濃度(MIC),比較分析和探討結(jié)核桿菌Pup-蛋白酶體系統(tǒng)基因缺失突變對(duì)其耐藥性產(chǎn)生的的影響。
結(jié)果:1.成功構(gòu)建了結(jié)核桿菌Pup-蛋白酶體系統(tǒng)(包括Pup基因、Mpa基因、Dop基因、PafA基因)基因置換型缺失突變載體T-Pup-N-K-Pup-C、 T-Mpa-N-K-Mpa-C、 T-Dop-N-K-Dop-C和T-PafA-N-K-
3、PafA-C;2.成功構(gòu)建了Pup基因缺失突變株:INH-MTB△Pup、RFP-MTB△Pup、SM-MTB△Pup、EB-MTB△Pup、MDR-MTB△Pup和 Drug-sensitive-MTB△Pup,Mpa基因缺失突變株:INH-MTB△Mpa、RFP-MTB△Mpa、SM-MTB△Mpa、EB-MTB△Mpa、MDR-MTB△Mpa和Drug-sensitive-MTB△Mpa,Dop基因缺失突變株:INH-MTB△Do
4、p、RFP-MTB△Dop、SM-MTB△Dop、EB-MTB△Dop、MDR-MTB△Dop和 Drug-sensitive-MTB△Dop,PafA基因缺失突變株:INH-MTB△PafA、RFP-MTB△PafA、SM-MTB△PafA、EB-MTB△PafA、MDR-MTB△PafA和Drug-sensitive-MTB△PafA;3.刃天青顯色法測(cè)定了各組結(jié)核桿菌菌株的MIC,結(jié)果顯示:與原始耐藥結(jié)核桿菌菌株相比,單純耐一線抗
5、結(jié)核藥物和耐多藥的結(jié)核桿菌臨床分離株P(guān)up基因、Mpa基因和Dop基因缺失突變后,其MIC均出現(xiàn)不同程度下降,以Pup基因缺失株最為明顯;單純耐一線抗結(jié)核藥物和耐多藥的結(jié)核桿菌臨床分離株P(guān)afA基因缺失突變后,其MIC基本無變化;結(jié)核桿菌藥物敏感菌株P(guān)up基因、Mpa基因、Dop基因和PafA基因缺失突變后,MIC基本無變化。
結(jié)論:結(jié)核桿菌Pup-蛋白酶體系統(tǒng)Pup基因、Mpa基因和Dop基因缺失突變可使新疆地區(qū)流行的單純耐
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