維生素D3通過(guò)自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑調(diào)控豬腸道輪狀病毒感染研究.pdf

1、輪狀病毒是仔豬病原性腹瀉的主要致病因子之一，主要感染仔豬小腸成熟上皮細(xì)胞，其流行率可達(dá)80％，目前無(wú)特效藥治療。前人研究結(jié)果表明維生素D3對(duì)輪狀病毒感染發(fā)揮一定抗病毒作用。本研究旨在考察維生素D3是否通過(guò)調(diào)節(jié)自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激路徑對(duì)輪狀病毒感染發(fā)揮作用。試驗(yàn)一采用2×2因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，兩個(gè)主效應(yīng)分別為輪狀病毒應(yīng)激條件（灌服病毒和不灌服病毒）和日糧VD3添加水平(200IU和5000IU)，24頭DLY生長(zhǎng)豬（平均體重26.2±2.02 kg

2、）豬經(jīng)7d試驗(yàn)后采集空腸和回腸樣品，測(cè)定自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激路徑相關(guān)基因表達(dá)量。試驗(yàn)二以O(shè)US株輪狀病毒感染IPEC-J2細(xì)胞為模型，在篩選病毒接毒毒力和VD3添加水平的基礎(chǔ)上，研究自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激路徑在VD3影響輪狀病毒感染過(guò)程中發(fā)揮的作用。試驗(yàn)結(jié)果表明:
　　(1)豬體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，灌服輪狀病毒提高腸道GRP78、XBP1、IRE1、ATF6和CHOP的相對(duì)表達(dá)量(P＜0.05)，飼糧添加高劑量VD3能夠在一定程度上抑制上述基因的表

3、達(dá)上調(diào);與對(duì)照組比較，輪狀病毒提高自噬標(biāo)志基因Beclin1的表達(dá)，添加高劑量VD3顯著提高LC3-Ⅱ/Ⅰ和PR-39的相對(duì)表達(dá)量(P＜0.05)。
　　(2)感染輪狀病毒降低IPEC-J2細(xì)胞活力，隨感染復(fù)數(shù)增加而降低，當(dāng)感染復(fù)數(shù)為1時(shí)出現(xiàn)顯著性差異(P＜0.05)。
　　(3)維生素D3對(duì)輪狀病毒感染細(xì)胞活力無(wú)顯著影響，但細(xì)胞培養(yǎng)上清液中輪狀病毒抗原和NSP4濃度隨VD3濃度增加而下降，當(dāng)VD3濃度高于1μmol/L時(shí)，

4、顯著降低輪狀病毒抗原和NSP4濃度(P＜0.05)。輪狀病毒感染顯著提高細(xì)胞GRP78和CHOP相對(duì)表達(dá)量（P＜0.05），VD3濃度高于0.5μmol/L時(shí)，顯著緩減因病毒感染導(dǎo)致的GRP78和CHOP相對(duì)表達(dá)量的上調(diào)(P＜0.05)。輪狀病毒感染對(duì)細(xì)胞Beclin1和PR-39基因表達(dá)無(wú)顯著影響，VD3濃度大于0.5μmol/L時(shí)，顯著提高細(xì)胞Beclin1和豬cathelicidin抗菌肽PR-39相對(duì)表達(dá)量(P＜0.05)。

5、r>　　(4)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激路徑方面，輪狀病毒感染顯著提高GRP78、XBP1、ATF6、CHOP和EDEM相對(duì)表達(dá)量(P＜0.05)，添加VD3顯著降低GRP78、CHOP和XBP1相對(duì)表達(dá)量(P＜0.05)。輪狀病毒感染條件下，經(jīng)TM處理極顯著提高GRP78、PDIA4、calnexin、calreticulin、IRE1、XBP1、ATF6、CHOP和EDEM相對(duì)表達(dá)量(P＜0.01)，添加VD3降低GRP78、calreticul

6、in、IRE1、ATF6、CHOP和EDEM相對(duì)表達(dá)量(P＜0.05);經(jīng)4-PBA處理GRP78、PDIA4、calnexin、CHOP和EDEM相對(duì)表達(dá)量極顯著降低(P＜0.01)，添加VD3無(wú)顯著性影響。輪狀病毒感染顯著增加細(xì)胞培養(yǎng)上清液中capase12含量（P＜0.05），添加VD3降低capase12含量(P＜0.05)。輪狀病毒感染條件下，經(jīng)TM處理caspase12含量與輪狀病毒應(yīng)激組的相當(dāng)，添加4-PBA后caspas

7、e12含量與接毒+VD3組的相當(dāng)。
　　(5)在自噬路徑方面，VD3降低細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NSP4濃度（P＜0.05），VD3分別與自噬抑制劑3-MA和BafA1處理對(duì)NSP4濃度無(wú)顯著影響，VD3與自噬激活劑Rap處理的NSP4濃度與VD3處理的NSP4濃度相當(dāng)。輪狀病毒感染與VD3處理顯著提高LC3-Ⅱ相對(duì)表達(dá)量(P＜0.05)，與接毒+VD3處理組相比，接毒+VD3+3-MA組LC3-Ⅱ相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P＜0.05)，接毒

8、+VD3+Baf A1組和接毒+VD3+Rap組LC3-Ⅱ相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著性差異。與輪狀病毒感染組相比，添加VD3后降低p62相對(duì)表達(dá)量(P＜0.05)，提高PMAP23、PG1-5和PR-39相對(duì)表達(dá)量（P＜0.05）。
　　綜上所述，本研究經(jīng)豬只體內(nèi)和IPEC-J2細(xì)胞模型體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，輪狀病毒感染導(dǎo)致腸道（腸細(xì)胞）發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和誘導(dǎo)自噬發(fā)生;添加VD3可在一定程度上緩減輪狀病毒感染，其可能途徑是通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激路徑和誘導(dǎo)