嗜酸乳桿菌不同成分對(duì)重型顱腦損傷小鼠腸神經(jīng)遞質(zhì)影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：嚴(yán)重創(chuàng)傷已成為當(dāng)今世界的公共健康問(wèn)題,促進(jìn)嚴(yán)重創(chuàng)傷應(yīng)激后的胃腸動(dòng)力恢復(fù)是護(hù)理和科研關(guān)注的焦點(diǎn)。重型顱腦損傷(severeheadinjury,SHI)在嚴(yán)重創(chuàng)傷中占首位,死亡率高達(dá)20％-50%。腸動(dòng)力障礙(intestinalmotilitydisturbance,IMD)是重型顱腦損傷的常見并發(fā)癥,臨床上以腸動(dòng)力不足更為常見。腸動(dòng)力不足不僅加重腸道內(nèi)環(huán)境紊亂,導(dǎo)致細(xì)菌移位,腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)不耐受,還可引發(fā)多種并發(fā)癥,直接影響救治效

2、果和臨床預(yù)后。因此,改善SHI后的腸動(dòng)力不足,不僅有利于腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)的順利實(shí)施,也是有效改善患者預(yù)后的重要治療措施。
　　腸神經(jīng)系統(tǒng)(entericnervoussystem,ENS)是保證胃腸道感覺、運(yùn)動(dòng)和分泌等復(fù)雜功能協(xié)調(diào)運(yùn)行最重要的基礎(chǔ)和核心,腸神經(jīng)系統(tǒng)受損可能是SHI后腸動(dòng)力不足的重要原因之一。有研究報(bào)道重型顱腦損傷后腸道平滑肌在缺血再灌注狀態(tài)下發(fā)生細(xì)胞及周圍組織結(jié)構(gòu)損傷,最終引起腸道收縮模式改變。在MODS大鼠模型中觀察到肌

3、間神經(jīng)叢內(nèi)氮能神經(jīng)和Cajal間質(zhì)細(xì)胞(intestitialcellofCajal,ICC)減少,導(dǎo)致興奮與抑制失衡,小腸運(yùn)動(dòng)障礙。課題前期研究已發(fā)現(xiàn),SHI后腸道ICC和平滑肌細(xì)胞均出現(xiàn)損傷,它們之間的縫隙連接蛋白Cx43表達(dá)降低,這些改變可能是引起重型顱腦損傷后腸動(dòng)力不足的原因之一。但SHI后腸神經(jīng)及神經(jīng)遞質(zhì)的變化還缺乏相關(guān)的觀察研究。因此,觀察和分析SHI后腸動(dòng)力不足ENS-ICC-平滑肌細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)調(diào)控通路中其上級(jí)調(diào)控系統(tǒng)腸神經(jīng)遞

4、質(zhì)在SHI后腸動(dòng)力不足的作用,可為進(jìn)一步深入揭示其機(jī)制提供理論依據(jù)。
　　參與腸神經(jīng)調(diào)控功能的主要興奮性神經(jīng)遞質(zhì)為乙酰膽堿(Ach),抑制性神經(jīng)遞質(zhì)一氧化氮(NO)。乙酰膽堿酯酶(AchE)在膽堿能神經(jīng)元胞體內(nèi)合成,是膽堿能神經(jīng)元的特殊標(biāo)志,與乙酰膽堿(Ach)的分布幾乎平行,故常作為研究膽堿能神經(jīng)元的標(biāo)志或估計(jì)Ach含量的間接指標(biāo)。一氧化氮(NitricOxide,NO)是ENS重要的抑制性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元,主要分布于肌間叢,能介導(dǎo)胃

5、腸道平滑肌松弛,以左旋精氨酸(L-Arg)為底物,由一氧化氮合酶(NOS)催化生成。因此,本實(shí)驗(yàn)以AchE和NOS兩大經(jīng)典神經(jīng)遞質(zhì)為主要觀察指標(biāo),探討以ENS為主線的重型顱腦損傷后腸動(dòng)力不足的可能機(jī)制。
　　嗜酸乳桿菌(LactobacillusAcidphilus,LA)是腸道重要的益生菌之一,屬于乳酸菌家族,因其屬于活性微生態(tài)制劑,能很好在胃腸道內(nèi)發(fā)揮其優(yōu)勢(shì)功能而備受推崇。目前用于臨床的微生態(tài)制劑多以活菌制劑為主,但活菌保存要

6、求一定的低溫條件,其存活率容易受存放條件和環(huán)境的影響、保質(zhì)期短、活性不穩(wěn)定,這些因素都在一定程度上影響了微生態(tài)制劑的應(yīng)用。因此,培養(yǎng)分離益生菌,探究其不同成分的作用已成為改良用菌方式、優(yōu)化微生態(tài)制劑的焦點(diǎn)。我們前期研究已證實(shí)嗜酸乳桿菌可明顯改善SHI后小鼠腸動(dòng)力不足,修復(fù)受損的ICC細(xì)胞網(wǎng)絡(luò),提高縫隙連接蛋白Cx43的表達(dá)水平等,但嗜酸乳桿菌及其不同成分對(duì)腸動(dòng)力上級(jí)調(diào)控系統(tǒng)腸神經(jīng)系統(tǒng)的影響還未見報(bào)道。
　　研究目的及理論意義：本研

7、究擬從腸神經(jīng)遞質(zhì)入手,初步探討嗜酸乳桿菌對(duì)改善重型顱腦損傷后腸動(dòng)力不足的可能機(jī)制。通過(guò)觀察嗜酸乳桿菌培養(yǎng)分離后不同成分對(duì)重型顱腦損傷小鼠小腸AchE和NOS的影響及腸動(dòng)力的影響,探討嗜酸乳桿菌及不同成分對(duì)重型顱腦損傷上級(jí)調(diào)控系統(tǒng)----神經(jīng)遞質(zhì)關(guān)鍵酶AchE和NOS的作用,初步探討嗜酸乳桿菌對(duì)重型顱腦損傷后腸道神經(jīng)遞質(zhì)的作用及不同成分對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)及腸動(dòng)力作用的效果,分析對(duì)比嗜酸乳桿菌分不同成分對(duì)腸動(dòng)力的改善效果和神經(jīng)遞質(zhì)的作用,為認(rèn)識(shí)嗜酸

8、乳桿菌改善SHI后腸動(dòng)力不足提供研究證據(jù),也為臨床治療重型顱腦損傷后腸動(dòng)力不足提供理論依據(jù)。
　　研究方法：①隨機(jī)數(shù)字表法將320只C57雄性小鼠進(jìn)行制模,制模成功共264只,(制模正常死亡率為30%左右),分為創(chuàng)傷組(S組)和假傷組(I組),每組各72只(n=72),分為1,3,7d三個(gè)時(shí)相點(diǎn),每個(gè)時(shí)相點(diǎn)24只小鼠,每天每時(shí)相點(diǎn)均分別灌胃嗜酸乳桿菌(LA)、嗜酸乳桿菌耗盡上清液(SCS)、活菌沉淀(P)和乳酸桿菌選擇性培養(yǎng)基(M

9、RS培養(yǎng)基)4種試劑,每組每種灌胃劑6只(小腸推進(jìn)率檢測(cè)制模成功120只,以相同方式分組)。②動(dòng)物模型制作:采用feeney自由落體法方法并改進(jìn),建立小鼠SHI模型。制模后4h,待動(dòng)物蘇醒后方可灌胃,每天灌胃1次,每次0.5mL,觀察記錄小鼠一般情況及大便性狀改變情況,于致傷后1、3、7d取全腸段丙酮固定,待指標(biāo)檢測(cè)。③應(yīng)用免疫熒光和免疫組化檢測(cè)ChAT陽(yáng)性細(xì)胞的改變,酶組化染色檢測(cè)其NOS陽(yáng)性細(xì)胞活性改變、采用葡聚糖藍(lán)灌胃,觀察小腸運(yùn)

10、動(dòng)功能的變化情況。
　　結(jié)果：
　　1.嗜酸乳桿菌分離培養(yǎng)后成分對(duì)重型顱腦損傷小鼠小腸AchE的影響
　　SHI組ChAT陽(yáng)性細(xì)胞在傷后1d即出現(xiàn)形態(tài)和數(shù)量上的改變,創(chuàng)傷1d后,嗜酸乳桿菌組陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著多于培養(yǎng)基對(duì)照組組(P<0.01);同時(shí)耗盡培養(yǎng)上清液組與培養(yǎng)基對(duì)照組與也存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),與P組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01),但培養(yǎng)基對(duì)照組與活菌沉淀組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);耗盡上清液組與嗜酸

11、乳桿菌組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),SCS,嗜酸乳桿菌組與活菌沉淀組有較顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05~0.01)。創(chuàng)傷3d和7d陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)均無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。假傷各組1d,3d,7d均無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　2.嗜酸乳桿菌分離培養(yǎng)后成分在相同時(shí)相點(diǎn)SHI組和I組ChAT陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)的變化
　　重型顱腦損傷組和假傷組在嗜酸乳桿菌灌胃后,1d時(shí)無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),創(chuàng)傷與假傷組在傷

12、后3d,ChAT陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),7d后創(chuàng)傷組灌胃嗜酸乳桿菌后細(xì)胞恢復(fù)到穩(wěn)定水平,與相同時(shí)相點(diǎn)假傷組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在灌胃耗盡上清液后,1d,7d損傷組和假傷組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),3d時(shí)出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。灌胃活菌沉淀后1d,損傷組與假傷組即出現(xiàn)明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01),3d無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),7d時(shí),損傷組與假傷組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(P<0.05)。

13、
　　3.嗜酸乳桿菌分離培養(yǎng)后成分對(duì)小腸收縮功能的影響
　　在SHI1d后,各組推進(jìn)率在灌胃嗜酸乳桿菌各成分后未出現(xiàn)明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,3d后嗜酸乳桿菌組與培養(yǎng)基組之間出現(xiàn)顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01),耗盡上清液組與培養(yǎng)基對(duì)照組間也出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;7d時(shí),嗜酸乳桿菌組與培養(yǎng)基對(duì)照組間的差異顯著(P<0.01),與活菌沉淀組間也出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),耗盡上清組組與培養(yǎng)基對(duì)照組間的差異顯著(P<0.01)。
　

14、　結(jié)論：
　　1.小鼠SHI后AchE活性降低,NOS活性增強(qiáng),嗜酸乳桿菌對(duì)受損的ChAT陽(yáng)性細(xì)胞起到修復(fù)和保護(hù)作用,能提高AchE的活性,并顯著抑制NOS的活性,從而起到促進(jìn)SHI后腸動(dòng)力恢復(fù)的作用。
　　2.ChAT在SHI后陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)出現(xiàn)明顯變化,嗜酸乳桿菌和其耗盡培養(yǎng)上清液對(duì)受損的ChAT陽(yáng)性細(xì)胞有顯著的保護(hù)和修復(fù)作用,而活菌沉淀并不能對(duì)ChAT細(xì)胞的數(shù)量產(chǎn)生影響,SCS中可能存在著嗜酸乳桿菌發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的某種生物