嗜酸乳桿菌對重型顱腦損傷小鼠小腸鈣敏感通路影響的研究.pdf

1、重型顱腦損傷(Severe head injury，SHI)所致的腸動力不足具有發(fā)生早、程度重、持續(xù)時間長的特點，其發(fā)生發(fā)展嚴重影響傷情轉(zhuǎn)歸及預后。腸動力不足不僅嚴重限制了早期腸內(nèi)營養(yǎng)的順利實施，而且若得不到有效改善后期容易導致營養(yǎng)不良、誤吸、細菌移位甚至誘發(fā)MODS等嚴重并發(fā)癥。促進胃腸功能的恢復能有效阻斷MODS進一步發(fā)展，因此積極糾正重型顱腦損傷后腸動力不足有益于患者預后和疾病轉(zhuǎn)歸。腸道收縮的基本單位是平滑肌細胞(smooth m

2、uscle cell，SMC)，其中20 kD肌球蛋白輕鏈(20 kD of myosin light chain，MLC20)是調(diào)控平滑肌收縮的重要結(jié)構(gòu)域，其絲氨酸第19號位點與磷酸基團(Pi)結(jié)合后發(fā)生磷酸化，引起粗細肌絲間相對移位，拉動細胞發(fā)生收縮?；A(chǔ)研究表明，MLC20磷酸化過程受多重信號級聯(lián)調(diào)控，鈣依賴性通路/鈣敏感通路是其中的兩條主要途徑，肌球蛋白輕鏈的磷酸酶(myosin light chainphosphatase，M

3、LCP)結(jié)構(gòu)中活性亞基MYPT1(Myosin phosphatase target subunit1)的磷酸化過程是鈣敏感通路的核心環(huán)節(jié)，受到通路上游Rho相關(guān)激酶(Rho-associatedkinase，ROCK)及Zipper相互作用蛋白激酶(Zipper-interacting protein kinase，ZIPK)等信號的聯(lián)合調(diào)控，參與多種胃腸動力障礙疾病的發(fā)生發(fā)展，然而該通路是否與重型顱腦損傷后腸道動力不足有關(guān)，尚不清楚

4、。目前臨床針對重癥患者出現(xiàn)的腸動力不足多采用藥物治療，但藥物產(chǎn)生的副作用還會加重病情。嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidphilus，La)可幫助改善功能性胃腸病、手術(shù)、感染等引起的胃腸動力不足，且作用溫和。課題組前期發(fā)現(xiàn)，嗜酸乳桿菌可改善重型顱腦損傷后小鼠腸傳輸率，調(diào)節(jié)傷后小腸離體肌條收縮頻率、幅度、張力的異常。結(jié)合前期研究和相關(guān)文獻，我們推測:重型顱腦損傷可能導致腸道平滑肌細胞結(jié)構(gòu)受損，鈣敏感通路傳導異常，進而出現(xiàn)腸道收

5、縮的力量不足;La調(diào)節(jié)SHI后IMD的作用機制可能與修復傷后受損的平滑肌細胞結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)鈣敏感通路中相關(guān)信號的傳導有關(guān)。
　　目的：
　　本課題旨在研究重型顱腦損傷所致腸動力不足產(chǎn)生的分子機制，選取嗜酸乳桿菌單菌進行干預，觀測其對調(diào)節(jié)胃腸動力信號中鈣敏感通路的影響，以進一步明確重型顱腦損傷對胃腸功能的影響以及嗜酸乳桿菌的作用機制，以期為該類益生菌在重癥創(chuàng)傷領(lǐng)域的合理應用提供理論參考。
　　方法：
　　1.建立重型顱

6、腦損傷致腸動力障礙小鼠模型將90只SPF級雄性C57bl/6小鼠隨機分為假傷組（對照組）、損傷組（SHI+MRS組）、La組（SHI+La組），各組又分別有1d、3d、7d三個時相點。采用方歡等改良的菲尼自由落體撞擊法，建立重型顱腦損傷后腸動力障礙小鼠模型。對照的假傷組小鼠只打開顱骨不進行沖擊致傷。假傷組和損傷組每日在相同時間點，灌胃0.5ml MRS（La專用）培養(yǎng)基，La組灌胃等體積La混懸液（含菌量≥1×1010 cfu/d），各

7、組其余時間均自由飲食水。
　　2.采用末端回腸組織HE染色病理切片，觀察小腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)等基本病理變化，測算平滑肌肌層厚度。
　　3.采用特異性生物素標記的免疫組織化學染色法，檢測MLC20、MLC20磷酸化、MLCP、MYPT1亞基磷酸化信號表達與分布。
　　4.采用酶聯(lián)免疫吸附測定法，檢測小鼠回腸組織內(nèi)MLCP表達量。
　　5.采用RT-PCR手段，檢測ROCK、ZIPK激酶基因表達水平。
　　結(jié)果：<

8、br>　　1.小腸組織病理及肌層厚度變化
　　HE染色結(jié)果顯示，假傷組小腸全層組織結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)正常;SHI組小鼠在1d、3d、7d時組織均出現(xiàn)明顯病理變化，并且隨時間進一步加重，出現(xiàn)腸黏膜上皮局灶性壞死，形成潰瘍，腸黏膜屏障嚴重受損;肌層厚度明顯變薄(vs.假傷組，1d，3dP＜0.05，7d P＜0.01)。嗜酸乳桿菌干預7d后小腸絨毛形態(tài)、高度、絨毛中段直徑與假傷組無顯著區(qū)別，間質(zhì)無水腫及炎癥反應，肌層未見明顯病理改變，厚度

9、正常。
　　2.MLC20及其磷酸化水平變化
　　免疫組化結(jié)果顯示，MLC20的表達在三組間無明顯差異。p-MLC20在SHI后1d、3d、7d的水平均明顯降低（vs.假傷組，P＜0.05）;嗜酸乳桿菌干預1d、3d、7d后p-MLC20顯著升高（vs.SHI組，P＜0.05）。
　　3.MLCP表達量與組織分布變化
　　ELISA結(jié)果顯示，MLCP表達量在SHI后1d、3d、7d的水平均顯著升高（vs.假傷組，

10、P＜0.01）;嗜酸乳桿菌干預1d、3d、7d后p-MLC20明顯降低(vs.SHI組，P＜0.05)。免疫組化結(jié)果與ELISA結(jié)果一致。
　　4.p-MYPT1組織分布變化
　　免疫組化結(jié)果顯示，p-MYPT1組織分布在SHI后1d、3d、7d均出現(xiàn)下降趨勢(vs.假傷組，P＜0.01）;嗜酸乳桿菌使用后使得1d、3d、7d的p-MYPT1表達升高(vs.SHI組，P＜0.01)。
　　5.ROCK基因水平變化

11、>　　PCR結(jié)果顯示，SHI后1d、3d、7d小腸組織ROCK基因表達均顯著降低（vs.假傷組，P＜0.01）。使用嗜酸乳桿菌1d后ROCK基因的表達即顯著升高(vs.SHI組，P＜0.05);干預3d和7d后均升高（vs.SHI組，P＜0.01）。
　　6.ZIPK基因水平變化
　　PCR結(jié)果顯示， SHI后1d、3d、7d小腸組織ZIPK基因表達均顯著降低（vs.假傷組，P＜0.01）。使用嗜酸乳桿菌1d和3d后ZIPK

12、基因的表達升高(vs.SHI組，P＜0.05);干預7d后顯著升高（vs.SHI組，P＜0.01）。并且在La組內(nèi)，不同時間點具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.重型顱腦損傷后腸動力不足小鼠小腸組織呈現(xiàn)平滑肌肌細胞排列紊亂，細胞變性，胞核固縮，炎癥細胞浸潤和間質(zhì)水腫的組織病理學改變;同時出現(xiàn)小腸平滑肌肌層變薄。
　　2.重型顱腦損傷后腸動力不足小鼠小腸組織中MYPT1磷酸化水平下降，MLCP表達量和活

13、性增加，腸道鈣敏感通路異常激活，MLC20磷酸化水平下降;同時出現(xiàn)ROCK與ZIPK基因表達水平下降。
　　3.嗜酸乳桿菌的干預使重型顱腦損傷后腸動力不足的小鼠小腸組織病理狀態(tài)得到改善，平滑肌細胞受損程度減輕，肌層厚度增加。
　　4.使用嗜酸乳桿菌后可以上調(diào)重型顱腦損傷后小腸ROCK與ZIPK基因水平;增加MYPT1的磷酸化，降低MLCP表達量和分布水平，抑制腸道鈣敏感通路的過度激活，維持MLC20磷酸化水平。
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