硫化氫促進(jìn)肝癌細(xì)胞HepG-2對阿霉素的耐受性及機(jī)制.pdf

1、【目的】：
　　建立以阿霉素(Adriamycin, ADM)殺傷肝癌細(xì)胞(HepG-2)為實驗?zāi)Ｐ?，探討硫化?hydrogen sulfide, H2S)促進(jìn)HepG-2細(xì)胞對ADM的耐受性及其機(jī)制。
　　【方法】：
　　1.體外培養(yǎng)HepG-2細(xì)胞，予ADM、NaHS作用細(xì)胞，CCK8法檢測ADM的IC50值。根據(jù) ADM的IC50值，設(shè)空白對照、ADM、ADM+NaHS、NaHS四組，流式細(xì)胞儀(FCM)檢測細(xì)

2、胞凋亡， Elisa法檢測 caspase-3蛋白表達(dá)。Western Blot檢測NaHS對多藥耐藥性蛋白Bcl-2、P-gp的表達(dá)。了解H2S是否促進(jìn)HepG-2細(xì)胞對ADM的耐受性。
　　2.體外培養(yǎng)HepG-2細(xì)胞，予ADM、NaHS和Gly作用細(xì)胞，CCK8法檢測ADM的IC50值。FCM檢測空白對照、ADM、ADM+NaHS、ADM+NaHS+Gly、Gly五組的細(xì)胞凋亡。Western Blot檢測空白對照、NaHS

3、、NaHS+Gly、Gly四組中Bcl-2、P-糖蛋白的表達(dá)。了解 KATP通道是否介導(dǎo)了H2S促進(jìn) HepG-2細(xì)胞對ADM的耐受性。
　　3.根據(jù)ADM的IC50值，設(shè)空白對照、ADM、ADM+NaHS、ADM+NaHS+K252a、K252a五組，分別采用 CCK8法和FCM檢測細(xì)胞活力及細(xì)胞凋亡。Western Blot檢測空白對照、NaHS、NaHS+K252a、K252a四組中Bcl-2、P-糖蛋白的表達(dá)及 NaHS對

4、BDNF的表達(dá)。了解 BDNF-TrKB通路是否介導(dǎo)了H2S促進(jìn)HepG-2細(xì)胞對ADM的耐受性。
　　【結(jié)果】：
　　1. H2S對HepG-2細(xì)胞中ADM的耐受性的影響
　　1.1.ADM的IC50值
　　NaHS(100、200、400μmol/L)組ADM的IC50值分別為0.59±0.05mg/L、0.78±0.07mg/L、1.42±0.08mg/L，高于空白對照組(單獨ADM處理，0.32±0.03

5、mg/L)(P<0.01, P<0.001)。
　　1.2.細(xì)胞凋亡
　　ADM組細(xì)胞凋亡率(77.9±0.9)％高于空白對照組(16.9±0.6)%(P<0.001)；ADM+NaHS組(25.7±2.3)%低于ADM組(77.9±0.9)%(P<0.001)；NaHS組細(xì)胞凋亡率(9.1±0.9)%低于空白對照組(16.9±0.6)%(P<0.01)。
　　1.3. Caspase-3表達(dá)
　　ADM組 Ca

6、spase-3蛋白表達(dá)水平(1.09±0.05ng/ml)高于空白對照組(0.53±0.03ng/ml)(P<0.001)；ADM+NaHS組 Caspase-3蛋白表達(dá)水平(0.81±0.03ng/ml)低于ADM組(1.09±0.05ng/ml)(P<0.01)；對照組與NaHS組無明顯差異(P＞0.05)。
　　1.4.Bcl-2、P-gp表達(dá)
　　NaHS(100、200、400μmol/L)組 Bcl-2的蛋白表達(dá)

7、水平高于空白對照組(P<0.05, P<0.001)；NaHS(200、400μmol/L)組P-gp的蛋白表達(dá)水平高于空白對照組(P<0.01, P<0.001)。
　　2. KATP通道對H2S促進(jìn)ADM耐受性的介導(dǎo)作用
　　2.1.ADM的IC50值
　　NaHS組 ADM的IC50值(0.78±0.07mg/L)高于對照 ADM組(0.32±0.03 mg/L)(P<0.001)；NaHS+Gly組ADM的IC

8、50值(0.58±0.01mg/L)低于NaHS組(0.78±0.07mg/L)(P<0.05)。
　　2.2.細(xì)胞凋亡率
　　ADM組細(xì)胞凋亡率[(77.9±0.9)%]高于空白對照組(16.9±0.6)%(P<0.001)；ADM+NaHS組[(25.7±2.3)%]低于 ADM組[(77.9±0.9)%](P<0.001)；ADM+NaHS+Gly組[(50.5±3.9)%]高于ADM+NaHS組[(25.7±2.3)

9、%](P<0.01)；對照組與Gly組無明顯差異(P＞0.05)。
　　2.3.Bcl-2、P-gp蛋白表達(dá)
　　NaHS組 Bcl-2、P-gp蛋白表達(dá)水平均高于空白對照組(P<0.05, P<0.01)；NaHS+Gly組 Bcl-2、P-gp蛋白表達(dá)水平均低于 NaHS組(P<0.05)；對照組與Gly組Bcl-2、P-gp蛋白表達(dá)水平無顯著差異(P＞0.05)。
　　3. BDNF-TrkB通路對H2S促進(jìn)AD

10、M耐受性的介導(dǎo)作用
　　3.1.BDNF蛋白表達(dá)
　　NaHS(100、200、400μmol/L)組BDNF的蛋白表達(dá)水平高于空白對照組(P<0.05, P<0.001)。
　　3.2.細(xì)胞活力
　　ADM組細(xì)胞活力(OD值：0.56±0.02)低于空白對照組(1.90±0.03)(P<0.001)；ADM+NaHS組細(xì)胞活力(1.39±0.09)高于ADM組(0.56±0.02)(P<0.001)；ADM+N

11、aHS+K252a組細(xì)胞活力(0.71±0.01)低于ADM+NaHS組(P<0.001)；對照組與K252a組無明顯差異(P＞0.05)。
　　3.3.細(xì)胞凋亡
　　ADM組細(xì)胞凋亡率[(77.9±0.9)%]高于空白對照組[(16.9±0.6)%](P<0.001)；ADM+NaHS組細(xì)胞凋亡率[(25.7±2.3)%]低于ADM組(77.9±0.9)%(P<0.001)；ADM+NaHS+K252a組[(46.0±5.

12、9)%]高于ADM+NaHS組[(25.7±2.3)%](P<0.05)；對照組與K252a組無明顯差異(P＞0.05)。
　　3.4.Bcl-2、P-gp蛋白表達(dá)
　　NaHS組 Bcl-2、P-gp蛋白表達(dá)水平高于空白對照組(P<0.05，P<0.001)；NaHS+K252a組Bcl-2、P-gp蛋白表達(dá)水平低于NaHS組(P<0.05，P<0.01)；對照組與K252a組Bcl-2、P-gp蛋白表達(dá)水平無顯著差異(P