肝靜脈閉塞病中與Notch1信號通路相互作用的lncRNA的篩選及初步驗證.pdf

1、目的：本實驗旨在研究Notch1信號通路對異基因造血干細胞移植（hematopoietic stem cell transplantation，HSCT）后肝靜脈閉塞病(hepaticveno-occlusive disease，HVOD)受損肝細胞的修復(fù)作用，并通過肝細胞基因芯片篩選與Notch1信號通路相互作用的長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)，并進一步分析lncRNA與Notch1信號通路之間

2、的相互作用關(guān)系。
　　方法：1.將8～10周齡雄性BALB/c(H-2d)小鼠經(jīng)致死劑量全身照射(totalbody irradiation，TBI)后，隨機分為TBI組及異基因HSCT組，正常小鼠為對照組。移植當天為0天，分別于移植后第0、7、14及33天取受鼠肝臟稱重后計算肝臟指數(shù)，留取血漿檢測肝功能(膽紅素、ALT和AST)及細胞因子（TNF-α、TGF-β、IL-1、IL-6及HGF）;HE染色觀察肝臟組織受損情況，電鏡觀

3、察肝細胞超微結(jié)構(gòu)變化;2.TBI及HSCT后第0、7、14及33天，percoll密度梯度離心法分離、純化受鼠肝細胞，分別用實時熒光定量PCR及Western blot檢測肝細胞內(nèi)Notch1信號通路相關(guān)分子的mRNA及蛋白水平變化;3.提取肝細胞總RNA，經(jīng)質(zhì)量及完整性檢測后，用于制作肝細胞lncRNA基因芯片;4.對基因芯片數(shù)據(jù)進行整理、分析，篩選與Notch1信號通路相互作用的lncRNAs，熒光定量PCR檢測與Notch1信號通

4、路相互作用lncRNAs的mRNA水平，并進一步分析Notch1信號通路分子與其相互作用lncRNAs的同源性。
　　結(jié)果:1.TBI及HSCT對肝臟的損傷:TBI組小鼠在11天內(nèi)全部死亡，病理顯示照射后第7天肝竇內(nèi)皮脫落、肝細胞水腫并出現(xiàn)少量點狀壞死，此時小鼠肝指數(shù)水平也達到最高，膽紅素、ALT及AST水平高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），至第10天肝細胞損傷進一步加重，腫脹、壞死較前增多，肝竇內(nèi)有出血，肝小葉結(jié)

5、構(gòu)不清。而HSCT后第7天，受鼠肝細胞損傷較同時間點TBI組小鼠重，至第14天肝細胞損傷最嚴重，肝細胞腫脹、壞死、肝竇內(nèi)皮脫落、Disse間隙水腫并肝竇內(nèi)出血，此時小鼠肝指數(shù)水平亦達最高，肝功能較前雖下降，但仍高于正常水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);至第33天肝細胞損傷雖較前好轉(zhuǎn)，但炎性細胞浸潤增多，且受鼠肝指數(shù)及肝功能在HSCT后33天內(nèi)持續(xù)高于正常水平，提示移植后肝臟損傷由TBI和HSCT共同引起。2.照射及HSCT后，肝細

6、胞內(nèi)Notch1通路分子的mRNA水平呈先降后升的趨勢，在第14天時降至最低，隨后其表達水平升高，Notch1信號通路分子蛋白水平變化趨勢與mRNA水平變化趨勢相同。3.成功分離、純化移植后受鼠的肝細胞，并提取肝細胞總RNA，瓊脂糖凝膠電泳快速檢測RNA完整性良好，可用于基因芯片制作。4.經(jīng)過對肝細胞基因芯片數(shù)據(jù)整理、分析，篩選出與差異性表達顯著的Notch1通路分子Notch1、Dl14及Hes7相互作用的lncRNAs0610009

7、E02Rik、Gm14207及AL645527.1，進一步研究發(fā)現(xiàn)這些lncRNAs與Notch1、Dl14及Hes7具有顯著相關(guān)性。5、同源性分析表明lncRNAs0610009E02Rik與Notch1具有同源性。
　　結(jié)論:1.照射及HSCT共同作用，損傷肝竇內(nèi)皮和肝細胞、破壞肝功能，致細胞因子分泌紊亂，引起肝細胞不可逆性損傷;2.Notch1信號通路參與移植后受損肝細胞的修復(fù);3.lncRNA0610009E02Rik是N