創(chuàng)傷失血模型中Notch1信號通路對心肌凋亡的保護(hù)機(jī)制以及心肌保護(hù)藥物的篩選.pdf

1、嚴(yán)重創(chuàng)傷失血(traumatic hemorrhage)是直接威脅患者生命安全的危急重癥之一，常伴發(fā)全身系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)，繼而對機(jī)體重要臟器造成損害。
　　腫瘤壞死因子是機(jī)體在受到創(chuàng)傷刺激后產(chǎn)生的一種內(nèi)源性多效調(diào)節(jié)因子，與心血管疾患的進(jìn)展緊密相關(guān)，且呈明顯的雙向效應(yīng)。近年來，其在凋亡以及創(chuàng)傷修復(fù)過程中的調(diào)節(jié)作用日益引發(fā)關(guān)注。
　　Notch信號通路對細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸具有決定性作用，其參與維持機(jī)體組織結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定，以及損傷后的修復(fù)

2、過程。但創(chuàng)傷失血后，其對心肌細(xì)胞能夠產(chǎn)生何種影響，目前尚不知曉。
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
　　通過對創(chuàng)傷失血誘導(dǎo)大鼠心肌凋亡模型進(jìn)行研究，探討Notch1信號對心肌細(xì)胞的保護(hù)性轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，篩選能夠保護(hù)心肌免于凋亡的相關(guān)藥物，為深入了解創(chuàng)傷失血的損傷機(jī)理及治療預(yù)防研究奠定一定的基礎(chǔ)。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　第一部分:創(chuàng)傷失血誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞凋亡及藥物保護(hù)機(jī)制的初步評估
　　1、構(gòu)建急性創(chuàng)傷性失血大鼠模型，隨機(jī)分為五組(n

3、=10)，實(shí)驗(yàn)組分別給予螺內(nèi)酯、瑞舒伐他汀及厄貝沙坦干預(yù)，對照組及創(chuàng)傷組正常喂養(yǎng)。2、ELISA檢測各組大鼠血清0h、1h、2h、4h、8h、12h、16h、24h、48h時間點(diǎn)IL-2、IL-6、IL-10及TNF-α水平變化;取心肌組織行HE染色;WB及rt-PCR檢測心肌Bcl-2/Bax的表達(dá)、以及Akt/Notch1/Hes1通路的表達(dá)。
　　第二部分:低濃度TNF-α激活A(yù)kt/Notch1/Hes1信號通路及其對心肌

4、細(xì)胞凋亡的影響機(jī)制
　　1、體外心肌細(xì)胞培養(yǎng)，構(gòu)建創(chuàng)傷引發(fā)心肌凋亡模型;2、Tunel法檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生;3、檢測低濃度TNF-α對心肌細(xì)胞Bcl-2/Bax與caspase-3，9的表達(dá)的調(diào)控作用，以及siRNA敲低Notch1表達(dá)后的變化;4、檢測低濃度TNF-α對心肌細(xì)胞Akt/Notch1/Hes1通路的影響，以及敲低Notch1表達(dá)后的變化;5、過表達(dá)Notch1信號，檢測Bcl-2/Bax的變化。
　　第三部分

5、:瑞舒伐他汀、螺內(nèi)酯及厄貝沙坦在創(chuàng)傷失血導(dǎo)致心肌凋亡過程中的保護(hù)作用及比較
　　1、體外構(gòu)建創(chuàng)傷刺激致心肌凋亡模型，檢測caspase-3，9和Bcl-2/Bax的表達(dá)以及藥物干預(yù)后的變化。2、瑞舒伐他汀、螺內(nèi)酯和厄貝沙坦干預(yù)后，分別比較各組心肌細(xì)胞caspase-3，9、Bcl-2/Bax、和Akt/Notch1/Hes1信號通路的變化，以及siRNA敲低Notch1表達(dá)后的影響。
　　結(jié)果:
　　第一部分:創(chuàng)傷失血

6、誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞凋亡及藥物保護(hù)機(jī)制的初步評估
　　1、創(chuàng)傷失血后1h時，大鼠血清中TNF-α達(dá)峰值;4h時IL-6及IL-10達(dá)最高值;8h時，IL-2含量最低;隨時間延長，IL-2、IL-6、IL-10和TNF-α均逐漸恢復(fù)至基礎(chǔ)水平;藥物干預(yù)組TNF-α水平較創(chuàng)傷組顯著升高，且持續(xù)時間延長(p＜0.05)。2、HE染色:創(chuàng)傷組心肌組織可見形態(tài)改變、腫脹和巨噬細(xì)胞聚集;藥物處理組心肌細(xì)胞體積縮小、周圍炎癥細(xì)胞減少。3、創(chuàng)傷組大鼠

7、心肌Bax表達(dá)上調(diào)，Bcl-2表達(dá)下調(diào)，(p＜0.05);藥物干預(yù)后， Bax表達(dá)降低，Bcl-2表達(dá)升高，(p＜0.05)。4、藥物干預(yù)后大鼠心肌細(xì)胞中Akt/Notch1/Hes1信號通路被激活，Notch1/NICD/Hes1表達(dá)增加(p＜0.05)。
　　第二部分:低濃度TNF-α激活A(yù)kt/Notch1/Hes1信號通路及其對心肌細(xì)胞凋亡的影響機(jī)制
　　1、予創(chuàng)傷血清進(jìn)行心肌培養(yǎng)，刺激心肌細(xì)胞產(chǎn)生凋亡;WB及rt-

8、PCR檢測提示caspase-3，9增加、Bax上調(diào)/Bcl-2下調(diào)(p＜0.05)。2、給予低濃度TNF-α干預(yù)后，心肌凋亡減輕; caspase-3，9減少、Bax下調(diào)/Bcl-2上調(diào)(p＜0.05)。3、予siRNA敲低Notch1表達(dá)后，凋亡再次加重;caspase-3，9表達(dá)增加、Bax活化/Bcl-2受到抑制(p＜0.05)。4、WB及rt-PCR檢測提示低濃度TNF-α能夠激活A(yù)kt/Notch1/Hes1信號通路;分別給

9、予TNF-α阻斷劑及siRNA敲低Notch1表達(dá)干預(yù)后，Akt/Notch1/Hes1信號被抑制。5、轉(zhuǎn)染質(zhì)粒Notch1信號過表達(dá)后,Bax下調(diào)/Bcl-2上調(diào)。
　　第三部分:瑞舒伐他汀、螺內(nèi)酯及厄貝沙坦在創(chuàng)傷失血導(dǎo)致心肌凋亡過程中的保護(hù)作用及比較
　　1、Tunel實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，藥物干預(yù)均能程度不同地減輕心肌凋亡。2、瑞舒伐他汀組:經(jīng)WB及rt-PCR測定證實(shí)caspase-3，9表達(dá)下調(diào)，Bax抑制/Bcl-2激活，A

10、kt/Notch1/Hes1活化(p＜0.05);敲低Notch1的表達(dá)后，呈現(xiàn)相反的表現(xiàn)(p＜0.05)。3、螺內(nèi)酯組:同瑞舒伐他汀組，但敲低Notch1后，caspase-9及Bcl-2的變化無統(tǒng)計(jì)差異。4、厄貝沙坦組:同瑞舒伐他汀組，但敲低Notch1的表達(dá)后，caspase-9、Bax/Bcl-2表達(dá)變化無統(tǒng)計(jì)差異。
　　結(jié)論:
　　1、創(chuàng)傷失血大鼠模型給予心肌保護(hù)藥物干預(yù)后，血清TNF-α升高且與創(chuàng)傷組相比，能長時

11、間地保持相對較高的低濃度狀態(tài)。
　　2、低濃度TNF-α能夠激活A(yù)kt/Notch1/Hes1信號通路，通過Notch1通道內(nèi)源性保護(hù)作用，使心肌細(xì)胞免于創(chuàng)傷導(dǎo)致的凋亡。
　　3、螺內(nèi)酯、瑞舒伐他汀及厄貝沙坦能夠保護(hù)細(xì)胞免于創(chuàng)傷反應(yīng)引發(fā)凋亡。瑞舒伐他汀通過上調(diào)TNF-α，激活A(yù)kt/N otch1/Hes1信號通路，調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax比例以減少細(xì)胞凋亡，發(fā)揮保護(hù)心肌作用;螺內(nèi)酯組亦可以上調(diào)TNF-α，激活A(yù)kt/Notc