Notch通路中Notch1分子和Akt信號在骨髓瘤鼠模型中腫瘤增長作用的研究.pdf

1、背景：多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是嚴重威脅人類健康的造血系統(tǒng)惡性疾患，其發(fā)生發(fā)展與骨髓瘤細胞的異常增殖和微環(huán)境的血管生成密切相關(guān)，骨髓瘤細胞增殖比例低以及對多種藥物耐藥的形成，使得MM的臨床治療仍十分困難。Notch信號通路與MM的發(fā)生具有密切的聯(lián)系，骨髓瘤細胞和骨鏈瘤基質(zhì)細胞表達大量Notch受體和配體，激活Notch信號通路對骨髓瘤的發(fā)生和耐藥起重要作用。Akt與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，有學(xué)者報道No

2、tch信號和PI3K/Akt通路可相互激活。γ-分泌酶抑制劑(gamma secretase inhibitor，GSI)能夠有效抑制Notch1的激活，近期多數(shù)研究報道蛋白酶體抑制劑誘導(dǎo)MM細胞株凋亡的同時伴有Notch1表達的降低，用GSI阻斷Notch1可降低Akt的表達，促進腫瘤細胞的凋亡。因此，我們利用GSI下調(diào)Notch表達深入探討Notch1及Akt在MM小鼠模型中的作用及其機制。
　　 目的：研究GSI抑制Not

3、ch1及Akt的激活對腫瘤的增長、細胞因子分泌等生物學(xué)行為的影響和腫瘤血管生成的改變，探討Notch1及Akt在MM小鼠模型中的作用及其機制。將為MM的靶向治療提供理論依據(jù)和實驗室基礎(chǔ)。
　　 方法：⑴體外培養(yǎng)MM細胞株RPMI8226，將人骨髓瘤細胞株RPMI8226細胞通過皮下注射接種于糖尿病抵抗/重癥聯(lián)合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠，建立異體移植動物模型。⑵連續(xù)監(jiān)測骨髓瘤細胞在小鼠體內(nèi)的生長情況，觀察腫瘤的大小變化。⑶

4、分別應(yīng)用GSI、生理鹽水瘤內(nèi)注射各一組小鼠(9只)，觀測實驗組(GSI組)、對照組(生理鹽水組)腫瘤增長的變化。⑷免疫組織化學(xué)方法：分離、摘除小鼠皮下瘤塊，用10％甲醛固定、石蠟包埋并進行蘇木精-伊紅染色；免疫組織化學(xué)方法檢測Notch1、Akt表達及定位。⑸Western blot檢測通路相關(guān)蛋白表達情況：分離、摘除小鼠皮下瘤塊，液氮研磨后，提取細胞總蛋白，Western blot檢測Notch1、Akt蛋白的表達情況。
　　

5、 結(jié)果：①成功建立于糖尿病抵抗/重癥聯(lián)合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠異體移植動物模型。②移植成瘤率：接種骨髓瘤細胞株RPMI8226細胞5-14天(平均7天)后，18只NOD/SCID小鼠左側(cè)或右側(cè)腹股溝區(qū)均見可測腫塊，成瘤后第3天平均體積為5.26mm3，第6天平均體積為66.76mm3，第9天平均體積為274.48mm3，第12天平均體積為510.26mm3，成瘤率100％。③實驗動物的一般狀況：對照組(生理鹽水組)NOD/SC

6、ID小鼠隨著腫瘤體積的增大精神逐漸萎靡、活動減少、皮膚光澤度差、飲食飲水量減少；而實驗組(注射GSI藥物)小鼠精神狀態(tài)、活動皮膚光澤、飲水、飲食量優(yōu)于對照組；檢測腫瘤體積變化結(jié)果表明GSI可抑制多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226細胞荷瘤NOD/SCID鼠移植腫瘤在體內(nèi)的生長。在骨髓瘤小鼠模型中，實驗組移植瘤平均體積(683.5mm3)較對照組(1798.7mm3)明顯減小，p<0.01。④腫瘤免疫組化方法檢測Notch1、Akt定位及表達：N

7、otch1定位于細胞膜、細胞胞漿或胞核內(nèi)，Akt主要定位于細胞胞漿，其次定位于細胞膜或細胞核。實驗組和對照組Notch1陽性率分別為11.1％和95.6％，Akt陽性率分別為13.3％和93.3％，實驗組Notch1及Akt較對照組表達明顯減少。⑤Western blot結(jié)果顯示：實驗組Notch1基因及Akt基因蛋白質(zhì)的表達明顯低于對照組，提示GSI可抑制Notch1、Akt蛋白的表達。
　　 結(jié)論：⑴通過多發(fā)性骨髓瘤移植瘤動