E-選擇素在長春瑞賓致輸液性靜脈炎中的作用機(jī)制及藥物調(diào)控研究.pdf

1、藥物輸液性靜脈炎是臨床常見的藥源性疾病之一，其發(fā)病率高、危害較大，給病人造成很多不必要的生理、心理痛苦和醫(yī)療支出，嚴(yán)重影響臨床藥物治療的依從性和療效。目前臨床上此類不良反應(yīng)發(fā)生較頻繁，但缺乏針對(duì)性強(qiáng)、效果可靠的防治措施，因此急需尋找理論依據(jù)，建立規(guī)范方案和有效措施。 本研究首先在小鼠和家兔體內(nèi)模擬了長春瑞賓導(dǎo)致輸液性靜脈炎的過程，利用兩種動(dòng)物考察了各種因素對(duì)其病理變化的影響；并應(yīng)用病理評(píng)分方法初步考察西咪替丁的干預(yù)效果；應(yīng)用免疫

2、組化法在動(dòng)物模型初步證實(shí)該類靜脈炎發(fā)生過程與E-selectin表達(dá)存在相關(guān)性；繼而采用免疫組化、ELISA法和流式細(xì)胞術(shù)分別定性和定量考察長春瑞賓、西咪替丁等各種藥物對(duì)E-selectin表達(dá)的影響；采用細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)法證實(shí)，在E-selectin蛋白表達(dá)的基礎(chǔ)上，其促進(jìn)細(xì)胞黏附的功能也發(fā)生了相應(yīng)的變化；采用real-timePCR法證實(shí)上述過程中E-selectin蛋白表達(dá)與其mRNA表達(dá)一致，提示該過程受其基因調(diào)控；為探討其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

3、途徑，采用NF-κB通路活性測(cè)定ELISA法同時(shí)測(cè)定內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)活化、磷酸化及總體NF-κB量，初步提示長春瑞賓上調(diào)E-selectin并導(dǎo)致輸液性靜脈炎的過程具有NF-κB通路依賴性。 第一部分長春瑞賓致輸液性靜脈炎動(dòng)物病理學(xué)研究及影響因素考察1.以新西蘭兔及昆明種小鼠為實(shí)驗(yàn)研究動(dòng)物，模擬臨床藥物治療中長春瑞賓致輸液性靜脈炎的過程。在家兔耳緣靜脈模型中，分別以內(nèi)皮細(xì)胞脫落、炎性細(xì)胞浸潤、血栓形成等病理學(xué)指標(biāo)評(píng)價(jià)并優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，考

4、察藥物作用時(shí)間、病理取材部位、給藥濃度、給藥速度等因素對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。結(jié)果選擇給藥速度12mL/h，濃度10mg/mL，劑量5mg/kg，藥物作用時(shí)間24h，病理取材部位2號(hào)位(針尖部進(jìn)針方向1cm)等為實(shí)驗(yàn)條件。 以小鼠尾靜脈模擬靜脈推注致藥物性靜脈炎的臨床過程，同樣應(yīng)用上述病理學(xué)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。 2.分別在上述兩種動(dòng)物模擬實(shí)驗(yàn)中，采用內(nèi)皮細(xì)胞損傷、炎性細(xì)胞浸潤、血栓形成、水腫程度等病理學(xué)分級(jí)指標(biāo)研究西咪替丁干預(yù)長春瑞

5、賓輸液性靜脈炎的效果。結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析證明，西咪替丁干預(yù)對(duì)輸液性靜脈炎各種病理學(xué)改變的發(fā)生率影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；但其對(duì)上述病理學(xué)改變的程度的減輕有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。證實(shí)該藥具有緩解靜脈炎癥狀的作用。 3.采用ELISA法考察家兔受長春瑞賓刺激后體內(nèi)各種血清學(xué)指標(biāo)的改變。包括黏附分子ICAM-1、VCAM-1、E-selectin、P-selectin，纖溶平衡系統(tǒng)指標(biāo)t-PA、PAI等指標(biāo)，結(jié)果提示E-s

6、electin在長春瑞賓刺激后有上升趨勢(shì)，可由(0.920±0.522)ng/mL升高至(1.534±0.449)ng/mL(P＜0.05)；而西咪替丁可較明顯地抑制該過程，使其表達(dá)自(1.715±0.354)ng/mL下調(diào)至(1.012±0.659)ng/mL(P＜0.05)；提示長春瑞賓致輸液性靜脈炎及西咪替丁的干預(yù)作用可能與其具有相關(guān)性。給藥前后的t-PA水平僅在VIN組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異(P＜0.01)，該水平下降了35.41％

7、，提示家兔血液纖溶系統(tǒng)平衡受到VIN給藥的影響，出現(xiàn)凝血機(jī)制加大的傾向。 第二部分E-selectin在長春瑞賓致輸液性靜脈炎過程中的表達(dá)及藥物的調(diào)控作用1.采用免疫組化方法檢測(cè)家兔模型、小鼠模型及內(nèi)皮細(xì)胞ECV304中E-selectin的表達(dá)，結(jié)果表明：E-selectin在正常動(dòng)物模型血管內(nèi)皮及未活化的內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)量很低，長春瑞賓刺激后的動(dòng)物血管內(nèi)皮及體外內(nèi)皮細(xì)胞均有明顯棕黃色陽性表達(dá)。 2.采用ELISA法測(cè)定

8、了ECV304細(xì)胞受不同劑量長春瑞賓、不同作用時(shí)間刺激后細(xì)胞培養(yǎng)液中可溶性E-selectin的含量。長春瑞賓可使其表達(dá)量自(930.939±103.040)pg/mL上調(diào)至(1278.467±62.197)pg/mL(P＜0.01)；西咪替丁可抑制上述E-selectin的表達(dá)，使其下調(diào)至(1070.267±103.040)pg/mL(P＜0.05)。而另一與內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞黏附作用相關(guān)的黏附分子sICAM-1變化缺乏相關(guān)性。

9、 3.采用流式細(xì)胞術(shù)考察了ECV304細(xì)胞受長春瑞賓刺激后細(xì)胞膜上E-selectin的含量變化。進(jìn)一步證實(shí)長春瑞賓具有上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞胞膜E-selectin表達(dá)(P＜0.01)的作用，而西咪替丁和富馬酸二甲酯則具有抑制其表達(dá)的作用。 4.采用ELISA法測(cè)定了9例臨床肺癌患者應(yīng)用長春瑞賓前后血清中可溶性E-selectin的水平，初步表明患者血清中的E-selectin水平在應(yīng)用長春瑞賓后可明顯上升，自(31.50±28.6

10、5)ng/mL升高至(43.08±44.49)ng/mL(P＜0.05)。提示E-selectin上升可能是該類藥物輸液性靜脈炎發(fā)生的重要因素。 上述結(jié)果表明：E-selectin參與了長春瑞賓致輸液性靜脈炎的病理過程，西咪替丁對(duì)該過程可能存在抑制作用，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞E-selectin的調(diào)控可能是其干預(yù)該類輸液性靜脈炎的作用機(jī)制之一。 第三部分長春瑞賓刺激對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞與中性粒細(xì)胞間黏附功能的影響及其與內(nèi)皮細(xì)胞E-select

11、in表達(dá)的相關(guān)性 采用虎紅染色比色法考察內(nèi)皮細(xì)胞系ECV304在受長春瑞賓刺激后，與外部加入的中性粒細(xì)胞黏附作用的變化。結(jié)果表明，以長春瑞賓刺激后，內(nèi)皮細(xì)胞與中性粒細(xì)胞共存體系染色后的OD值顯著增加(P＜0.05)，計(jì)算細(xì)胞黏附率最高可提高4.3倍；鏡下也觀察到對(duì)黏附率影響的程度具有差別，該趨勢(shì)與相同條件下內(nèi)皮細(xì)胞E-selectin的表達(dá)量具有一定相關(guān)性，表明長春瑞賓可能通過上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞E-selectin而增強(qiáng)其與粒細(xì)胞之間

12、的黏附作用；西咪替丁和富馬酸二甲酯等對(duì)此過程具有一定的抑制作用(P＜0.01)，分別對(duì)黏附率下調(diào)74.34％和84.65％。 以上發(fā)現(xiàn)表明，長春瑞賓可能通過上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞E-selectin的表達(dá)而增強(qiáng)白細(xì)胞與其黏附作用，從而引起內(nèi)皮損傷及白細(xì)胞穿越和浸潤等炎性發(fā)展過程，進(jìn)而向輸液性靜脈炎發(fā)展；而西咪替丁正是因?yàn)榫哂邢抡{(diào)上述E-selectin的作用，從而發(fā)揮了抑制輸液性靜脈炎相關(guān)癥狀表現(xiàn)的作用，可望作為臨床防治該類藥物性靜脈炎的

13、防治藥物。 第四部分長春瑞賓對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞E-selectin表達(dá)的基因調(diào)控研究 采用real-timePCR法測(cè)定長春瑞賓刺激內(nèi)皮細(xì)胞E-selectinmRNA的表達(dá)。長春瑞賓刺激內(nèi)皮細(xì)胞可引起E-selectinmRNA的表達(dá)，但較TNF-α刺激后水平略低；CIM可有效抑制VIN引起的E-selectinmRNA的表達(dá)(下調(diào)52.94％)，與其對(duì)TNF-α刺激后表達(dá)的抑制作用相當(dāng)(下調(diào)52.47％)；DMF對(duì)VIN和T

14、NF-α刺激后E-selectinmRNA表達(dá)的抑制作用都很強(qiáng)(分別下調(diào)68.10％和85.52％)。 上述結(jié)果提示，E-selectin在長春瑞賓致輸液性靜脈炎發(fā)生機(jī)制中具有重要的作用。由于藥物刺激引起E-selectin基因在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，并使細(xì)胞膜上E-selectin蛋白迅速表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞與粒細(xì)胞等黏附增強(qiáng)，啟動(dòng)血管內(nèi)皮損傷、炎性改變、血栓形成等一系列病理學(xué)過程，最終引起靜脈炎的發(fā)生。 第五部分長春瑞賓

15、上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞E-selectin表達(dá)作用與NF-κB通路的相關(guān)性初步考察1.采用免疫組化法在動(dòng)物及內(nèi)皮細(xì)胞模型檢測(cè)長春瑞賓刺激后，核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB在內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)。證實(shí)長春瑞賓及TNF-α可引起NF-κBp65在內(nèi)皮細(xì)胞的陽性表達(dá)，西咪替丁及DMF可減弱其表達(dá)。提示NF-κB通路可能是長春瑞賓導(dǎo)致E-selectin表達(dá)過程中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的途徑之一；西咪替丁可通過NF-κB通路抑制E-selectin表達(dá)。 2.采用NF-κB通

16、路活性ELISA測(cè)定法，同時(shí)測(cè)定長春瑞賓刺激內(nèi)皮細(xì)胞后NF-κBp65總量、活化的NF-κBp65及磷酸化的NF-κBp65量，研究各種藥物對(duì)長春瑞賓引起E-selectin表達(dá)過程中，NF-κB通路活化狀態(tài)和活化程度。結(jié)果提示，長春瑞賓刺激后，內(nèi)皮細(xì)胞中NF-κBp65活化并發(fā)生Ser536位點(diǎn)磷酸化，其NF-κB發(fā)生核內(nèi)移位，上述信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能引起核內(nèi)E-selectin基因表達(dá)，從而引起胞膜E-selectin表達(dá)；DMF和CI

17、M均存在抑制NF-κB向核內(nèi)易位的作用。 通過本課題的研究，在動(dòng)物體內(nèi)及人體內(nèi)初步考察了長春瑞賓致輸液性靜脈炎的病理改變，并在體外利用內(nèi)皮細(xì)胞系ECV304考察了E-selectin蛋白表達(dá)、黏附功能變化及其與E-selectinmRNA和NF-κB等變化的相關(guān)性，為考察藥物輸液性靜脈炎及其影響因素和發(fā)生機(jī)制進(jìn)行了初步研究；較系統(tǒng)地闡明了E-selectin在長春瑞賓致輸液性靜脈炎過程中的作用及調(diào)控機(jī)制，為長春堿類藥物所致的輸液