人肝癌細(xì)胞中DHRS4LI選擇性剪切新亞型的鑒定和分析.pdf

1、全反式維甲酸（all-trans Retinoic Acid，atRA)是體內(nèi)類激素樣生理活性物質(zhì)，在哺乳動(dòng)物包括人類，成體內(nèi)atRA 濃度過高或過低都可能會(huì)導(dǎo)致各種疾病和腫瘤的發(fā)生。在體內(nèi)，atRA 是由維生素A（vitamin A ）也稱視黃醇(Retinol)經(jīng)兩步代謝生成，其中間代謝產(chǎn)物為視黃醛(Retinal)。成體內(nèi)Retinal的生理作用劑量范圍也很窄，過高或過低均可會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不利影響。因此，體內(nèi)atRA和Retinal

2、的代謝均受到嚴(yán)格精細(xì)的調(diào)控作用，整個(gè)代謝過程是一個(gè)由多酶參與的調(diào)節(jié)過程。
　　 近年來本課題組一直致力于一種全稱為輔酶Ⅱ依賴性視黃醇脫氫/還原酶（NADP(H)-dependent retinol dehydrogenase/ reductase，NRDR ）的短鏈脫氫酶（short-chain dehydrogenase/reductase，SDR ）的研究。NRDR 最早從兔肝細(xì)胞質(zhì)溶膠中純化得到，是atRA代謝中的限速酶，

3、具有很高的視黃醇氧化、視黃醛還原活性，且廣泛分布于哺乳動(dòng)物組織中。較之于短鏈脫氫酶家族中已知的其它成員，NRDR 在生理?xiàng)l件下表現(xiàn)出更強(qiáng)的視黃醛還原活性，因此，它在維持體內(nèi)RA 及Retinal的代謝平衡中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。
　　 Genebank中登陸號(hào)為AB045133的cDNA 被認(rèn)為是NRDR的編碼基因，稱為DHRS4。
　　 人DHRS4基因簇有三個(gè)基因拷貝，分別為DHRS4，DHRS4L2與DHRS4L1（

4、又稱為DHRS4X ），其中前二者相似性很高（90%-98%；≥1kb ）屬于片段復(fù)制(SegmentalDuplication)。DHRS4L1與DHRS4和DHRS4L2 之間的同源性分別為77.8%和77.7%。在研究基因表達(dá)與調(diào)控的過程中，我們發(fā)現(xiàn)DHRS4基因簇的3個(gè)拷貝基因存在非常復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄及選擇性剪接方式，從而產(chǎn)生多種選擇性剪接亞型，這些剪接亞型在不同組織中表達(dá)情況的差異具有重要的臨床意義。本研究從人肝癌細(xì)胞HepG2中鑒

5、定出DHRS4L1 選擇性剪接新亞型，檢測(cè)其在不同組織和細(xì)胞中的表達(dá)情況，并探討其臨床意義。
　　 我們首先采用RACE（cDNA 末端快速擴(kuò)增法）方法成功地從HepG2 細(xì)胞中獲得選擇性剪接新亞型的3 ’末端cDNA 序列，鑒定其結(jié)構(gòu)推測(cè)其5 ’末端cDNA 序列，進(jìn)而得到其cDNA 序列，全長(zhǎng)1117bp；運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)新亞型序列進(jìn)行分析比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該新亞型的cDNA 序列與DHRS4LI基因高度同源，命名為DHRS4L

6、1A1 ；通過人基因組Blast分析，該新亞型DHRS4L1A1 由于選擇性剪接造成了第3~7 外顯子丟失，并保留第2 外顯子和第3 外顯子之間一段長(zhǎng)度為85bp內(nèi)含子序列，結(jié)構(gòu)為E1-E2-insertion-E8-E9-E10 ；通過查找開放閱讀框架，發(fā)現(xiàn)該剪接新亞型的可閱讀框架在1~699bp之間，預(yù)測(cè)其編碼的蛋白質(zhì)序列為232個(gè)氨基酸，具有SDR 家族2個(gè)保守的模序TAXXXGXG與YXXSK 及過氧化物酶體定位信號(hào)SRL。用R