粘附分子和JNK信號在胸主動脈瘤形成過程中的作用機制.pdf

1、前言：胸主動脈瘤是一種常見的潛在的致命性血管外科疾病,因發(fā)病兇險,死亡率高,嚴重威脅人民群眾生命健康,因此對該病的研究具有極其重要的臨床和社會價值。
　　 主動脈瘤是一種多因素疾病,受細胞內和細胞外信號的雙重調控,是血管壁細胞種類和數(shù)量改變以及細胞外基質病理性重塑的結果。主要病理學改變包括:動脈壁慢性透壁炎癥、中膜平滑肌細胞缺失、膠原蛋白和彈力蛋白減少。
　　 炎癥在心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮關鍵性的作用。動脈瘤或

2、動脈粥樣硬化均有白細胞的浸潤,特別是巨噬細胞和T細胞,進而引起免疫反應和血管病變。浸潤的炎癥細胞釋放許多的炎癥因子,同時促進基質金屬蛋白酶的產(chǎn)生。目前,有數(shù)種分子在炎癥級聯(lián)反應發(fā)揮關鍵作用。其中粘附分子,包括VCAM-1和ICAM-1,在炎癥細胞募集過程中發(fā)揮重要作用。他們在炎癥反應中與白細胞的黏附,滾動和跨內皮遷移相關聯(lián)。免疫球蛋白樣分子ICAM-1在正常內皮細胞呈弱表達,而在暴露于炎癥因子的情況下,其表達迅速升高。在白細胞的聚集和黏

3、附過程中,VCAM-1主要通過與單核細胞和淋巴細胞上的反配體VLA-4相作用。MCP-1屬于CC趨化因子家族,是單核細胞,T淋巴細胞,自然殺傷細胞和嗜堿粒細胞潛在的激動劑。然而,關于近段胸主動脈炎癥疾病的研究很少,充分揭示炎癥分子對動脈瘤成瘤的作用,對胸主動脈瘤的治療是很關鍵的。
　　 C-Jun氨基末端激酶(JNK),是炎癥初期的信號分子,臨床和動物實驗證實其與腹主動脈瘤和腦動脈瘤的擴張相關。盡管已知JNK參與腹主動脈瘤的形成

4、,但由于胸主動脈和腹主動脈來自不同的胚層,二者動脈瘤發(fā)生的機制也有可能不同,本實驗通過研究活化的JNK通路在胸主動脈瘤的表達,進一步明確胸主動脈瘤的發(fā)病機制。
　　 姜黃素是從姜科植物中提取的一種相對分子量小的多酚類物質。大量研究證明,姜黃素具有抗炎、抗氧化、抗纖維化、抗血栓、抗癌、清除自由基等作用?？诜S素可以抑制實驗性小鼠腹主動脈瘤的發(fā)展。最近有研究報道,姜黃素對缺血再灌注心肌細胞的JNK磷酸化有抑制作用,進而遏制了JNK

5、磷酸化導致的心肌細胞凋亡。然而,姜黃素是否可通過拮抗胸主動脈瘤的JNK信號,從而減少胸主動脈平滑肌細胞凋亡、阻斷胸主動脈瘤的成瘤通路,國內外迄今尚未見報道。
　　 因此本項研究分三方面:
　　 1.通過檢測促炎性細胞遷移的MCP-1和粘附分子在早期胸主動脈瘤的表達,進一步闡釋炎癥信號在胸主動脈瘤的形成過程中的作用。
　　 2.通過探索胸主動脈瘤模型大鼠體內JNK信號的變化規(guī)律和JNK對細胞基質合成和平滑肌細胞凋亡

6、的調控特點,闡明JNK信號通路在胸主動脈瘤成瘤過程中的作用。
　　 3.通過用姜黃素拮抗JNK通路對胸主動脈瘤進行治療,評價姜黃素的血管保護作用,闡釋姜黃素對動脈瘤的治療機制。研究的結果為闡述胸主動脈瘤發(fā)病機制和逆轉方法提供科學依據(jù)。
　　 方法：
　　 第一部分:采用大鼠升主動脈狹窄后擴張動物模型為研究對象。應用超聲檢測儀和SZH立體顯微鏡觀察主動脈管徑的變化；應用組織學方法、掃描電鏡、免疫組織化學技術、及明膠

7、酶譜分析技術檢測胸主動脈瘤形成早期介導炎性細胞遷移的粘附分子和MMP的表達改變。
　　 第二部分:采用胸主動脈周圍敷氯化鈣誘導的胸主動脈瘤模型為研究對象,應用免疫組化技術檢測人及大鼠胸主動脈瘤炎癥上游信號JNK通路改變。應用SZH立體顯微鏡檢測動脈管徑變化;地衣紅和茜素紅染色觀察動脈結構改變；采用western blot技術、TUNEL技術檢測姜黃素對胸主動脈瘤JNK信號通路的抑制及對動脈壁細胞的保護作用。
　　 結果：

8、
　　 一、MCP-1,VCAM-1和ICAM-1在動脈瘤擴張早期的表達
　　 1、Wistar大鼠擴張升主動脈的形態(tài)學改變
　　 (1)動脈管徑改變術后8周,正常升主動脈無擴張,呈光滑圓管狀,動脈瘤可見明顯的動脈擴張。動脈瘤組動脈管徑較對照組管徑增長44.26％(對照組2.35±0.05 mm,動脈瘤組3.39±0.15 mm,p＜0.05)。
　　 (2)動脈瘤壁組織學改變HE染色可見主動脈瘤壁的結構

9、紊亂,伴有大量炎性細胞浸潤。Romeis地依紅染色可見正常升主動脈壁的彈力板排列規(guī)則、緊密,彈力板呈現(xiàn)連續(xù)狀態(tài);升主動脈瘤壁的彈力板排列混亂、各層之間間隔增大,并有斷裂現(xiàn)象。有時斷裂部位有炎性細胞浸潤。
　　 2、CD45,MCP-1,ICAM-1和VCAM-1在動脈瘤的表達
　　 (1)正常動脈管壁CD45陽性細胞僅在血管壁內膜有少量表達；相反,動脈瘤管壁的全層均可見CD45陽性細胞。
　　 (2)MCP-1,

10、ICAM-1和VCAM-1在正常升主動脈僅有少量表達,動脈瘤MCP-1表達明顯增強,主要定位于管壁內膜。VCAM-1主要定位于動脈瘤管壁內膜增厚的內皮細胞層。ICAM-1集中定位于動脈瘤管壁內皮,同時在中膜和外膜有大量散在的陽性染色。動脈瘤管壁MCP-1,ICAM-1和VCAM-1平均光密度較對照組顯著升高。
　　 3、MMP-2和MMP-9的表達正常動脈壁中的明膠酶活性很低,沒有顯示出降解條帶;動脈瘤時動脈壁中MMP-2、MM

11、P-9的活性和表達較正常動脈顯著升高。
　　 二、JNK信號在胸主動脈瘤形成中的機制
　　 1、胸主動脈瘤JNK信號表達人胸主動脈瘤組織p-JNK高表達,主要位于中膜,外膜少量表達。對Wistar大鼠胸主動脈瘤模型的JNK及其下游底物p-c-jun進行檢測,發(fā)現(xiàn)動脈瘤的p-JNK和p-c-Jun陽性細胞較正常動脈明顯增多。
　　 2、姜黃素對動脈瘤管徑的影響正常胸主動脈無擴張,氯化鈣處理的胸主動脈顯著擴張,形成動

12、脈瘤。而姜黃素治療組胸主動脈擴張程度較胸主動脈瘤組明顯降低,幾乎接近正常動脈管徑的水平。
　　 3、姜黃素對動脈瘤管壁彈力板和鈣沉積的影響(1)動脈瘤組動脈壁的彈力板較正常動脈的層數(shù)減少、變得平直。而用姜黃素治療組,動脈壁的彈力板層數(shù)目較動脈瘤組明顯增多。形態(tài)上也同正常動脈相似,呈波浪型膜狀。(2)茜素紅染色可見應用氯化鈣處理的動脈壁周圍有大量鈣的沉積,在動脈壁鈣沉積的部位血管呈現(xiàn)出局部擴張明顯,而姜黃素組動脈周圍幾乎沒有鈣的沉

13、積。
　　 4、姜黃素對JNK信號的抑制作用正常主動脈壁p-JNK僅有少量表達,而在動脈瘤壁中顯著升高。用姜黃素治療后由于下調了p-JNK的表達,使p-JNK的表達水平與正常水平接近。同時JNK的下游底物p-c-jun與p-JNK表達的結果相一致。動脈瘤壁中p-c-jun較正常動脈升高,姜黃素治療組則明顯下調p-c-jun的表達。
　　 5、姜黃素對動脈瘤管壁的細胞凋亡影響正常動脈壁幾乎沒有凋亡細胞存在,用CaCl2造模

14、的動脈瘤組TUNEL陽性細胞增多,表明有顯著的動脈瘤壁平滑肌細胞凋亡。用姜黃素治療組TUNEL陽性細胞出現(xiàn)率較動脈瘤組顯著降低。證明姜黃素可顯著降低動脈瘤管壁的細胞凋亡。
　　 6、姜黃素對bcl-2,baX和caspase-3表達水平的影響
　　 (1)隨凋亡的增加,動脈瘤組伴出現(xiàn)bax表達升高,bcl-2表達降低,bcl-2/bax的比值較正常組下降現(xiàn)象。
　　 (2)與動脈瘤組相比,姜黃素治療組則上調了bc

15、l-2/bax的比值。
　　 (3)檢測結果證明caspase-3在動脈瘤組也呈現(xiàn)明顯的高表達,而應用姜黃素治療后,其表達水平也顯著降低。
　　 結論：
　　 1、MCP-1,ICAM-1,VCAM-1,MMPs的表達及炎性細胞的浸潤與胸主動脈瘤早期擴張相關,這些炎癥因子在動脈擴張早期發(fā)揮重要作用,這一發(fā)現(xiàn)進一步證明炎癥因子確實參與胸主動脈瘤的成瘤過程。
　　 2、JNK信號在動脈瘤細胞外基質重構和平滑肌