散發(fā)型胸主動脈瘤lncRNA表達譜及HOTAIR作用機制研究.pdf

1、胸主動脈瘤是一種由于多種原因?qū)е轮鲃用}壁結(jié)構(gòu)破壞、強度減弱，發(fā)生瘤樣擴張或者膨出的高危性疾病。大多數(shù)胸主動脈瘤患者無明顯癥狀，但是可進行性擴大并發(fā)生致命性的并發(fā)癥，如瘤體破裂或主動脈夾層，預(yù)后兇險。影像技術(shù)的普及提高了胸主動脈瘤的早期診斷率，為避免并發(fā)癥的發(fā)生并延緩手術(shù)提供了藥物治療的時間。但是目前臨床并沒有有效藥物抑制胸主動脈瘤的擴大。而對于胸主動脈瘤發(fā)病機制的研究與理解是能否找到特異性治療方法的關(guān)鍵。雖然綜合征型和家族型胸主動脈瘤已

2、經(jīng)發(fā)現(xiàn)相關(guān)致病基因位點，但是占大多數(shù)的散發(fā)型胸主動脈瘤(STAA)的遺傳背景和發(fā)病機制仍不明確。新近發(fā)現(xiàn)的長鏈非編碼RNA(lncRNA)可以在多個水平調(diào)節(jié)基因表達，也被報道與多種心血管系統(tǒng)疾病相關(guān)。但是lncRNA在胸主動脈瘤領(lǐng)域的作用仍不清楚。本課題旨在通過研究胸主動脈瘤中l(wèi)ncRNA的表達譜差異，以及差異表達lncRNA(HOTAIR)對主動脈平滑肌細胞功能和細胞外基質(zhì)重塑的影響，來探索lncRNA在胸主動脈瘤發(fā)病機制中的作用。<

3、br>　　研究內(nèi)容包括以下兩部分：
　　第一部分 散發(fā)型胸主動脈瘤中l(wèi)ncRNA表達譜研究
　　目的:研究散發(fā)型胸主動脈瘤lncRNA表達譜差異，并找到可能與致病相關(guān)的目標lncRNA。
　　方法:選取2013年7月到2015年6月在阜外醫(yī)院行手術(shù)的胸主動脈瘤患者升主動脈瘤體組織樣本（STAA組）和行冠狀動脈搭橋術(shù)患者主動脈打孔組織樣本（對照組），經(jīng)年齡、性別等指標配對后，共4對樣本進行l(wèi)ncRNA+mRNA聯(lián)合芯片分

4、析。差異基因中挑選四條lncRNA(uc031qjh.1、ENST0000045164、HOTAIR、LIT3501)和2條mRNA（CTSB和TNFSF10），進行實時定量反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈式反應(yīng)(qRT-PCR)驗證芯片結(jié)果。對差異表達基因行Gene Ontology Enrichment分析、lncRNA-mRNA共表達分析和lncRNA靶基因預(yù)測。
　　結(jié)果:與對照組相比，STAA組中1105條(5％)lncRNA出現(xiàn)明顯

5、差異表達，其中151條(1％)表達上調(diào)，954條(4％)表達下調(diào)。差異表達的mRNA有1568條(5％)，其中1175條(4％)上調(diào)，393條(1％)下調(diào)。qRT-PCR結(jié)果與芯片結(jié)果基本一致，STAA組uc031qjh.1、ENST0000045164、LIT3501、CTSB和TNFSF10的相對表達量均明顯高于對照組，HOTIAR的相對表達量明顯低于對照組。富集最多差異表達基因的生物過程是血管新生、細胞外結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)、細胞外基質(zhì)調(diào)節(jié)、

6、白細胞遷移和細胞粘附。通過結(jié)合Gene Ontology分析和lncRNA-mRNA共表達分析，得到細胞外基質(zhì)相關(guān)lncRNA-mRNA共表達網(wǎng)絡(luò)，由277個lncRNA和50個mRNA組成，其中包括HOTAIR。
　　結(jié)論:散發(fā)型胸主動脈瘤中l(wèi)ncRNA表達譜與正常對照相比存在明顯差異。生物信息學分析顯示lncRNA HOTAIR可能與胸主動脈瘤相關(guān)。
　　第二部分 lncRNA HOTAIR對主動脈平滑肌細胞和細胞外基質(zhì)

7、的影響
　　目的:擴大樣本量驗證HOTAIR在胸主動脈瘤中的差異表達，并通過細胞實驗探索其對平滑肌細胞和細胞外基質(zhì)的影響。
　　方法:病例組選取2013年7月到2015年6月在阜外醫(yī)院行手術(shù)的胸主動脈瘤患者升主動脈瘤體組織樣本24例，對照組選取冠狀動脈搭橋術(shù)患者主動脈打孔組織樣本22例，心臟移植供體升主動脈樣本2例。通過qRT-PCR驗證HOTAIR在兩組間表達差異。體外培養(yǎng)主動脈平滑肌細胞(HASMC)，通過siRNA技術(shù)

8、沉默HOTAIR，觀察HASMC凋亡、增殖、Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)的改變，并通過RNA測序技術(shù)觀察mRNA表達譜差異及發(fā)生改變的信號通路。
　　結(jié)果:胸主動脈瘤中HOTAIR表達量降低，且與瘤體直徑呈負相關(guān)。沉默HOTAIR可以促進HASMC凋亡，抑制增殖。HASMC中沉默HOTAIR可以上調(diào)MMP-2的表達，下調(diào)Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的表達。RNA測序結(jié)果顯示沉默HOTAIR后差異表達基因共620條，其中

9、上調(diào)53條，下調(diào)567條。差異基因功能富集分析顯示改變最顯著的是平滑肌細胞收縮功能，共相關(guān)基因13條，均表達下調(diào)，包括ACTA2、CALD1、MYLK等。信號通路富集分析顯示MAPK、Wnt、TGF-beta等信號通路發(fā)生改變。
　　結(jié)論:散發(fā)型胸主動脈瘤中l(wèi)ncRNA HOTAIR表達量明顯降低。沉默HOTAIR可以通過損傷平滑肌細胞收縮功能和促進細胞外基質(zhì)重塑，進而可能引起胸主動脈瘤的發(fā)生。
　　散發(fā)型胸主動脈瘤中l(wèi)nc