鈣拮抗劑通過非鈣依賴磷脂酶A2介導(dǎo)的非L-型鈣通道阻斷作用抗心肌細胞缺氧復(fù)氧損傷的研究.pdf

1、鈣拮抗劑和本課題組研發(fā)的碘化氮正丁基氟哌啶醇（N-n-butyl haloperidol iodide,F2）可阻斷心肌細胞L-型鈣通道，拮抗鈣超載，減輕心肌缺血再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)損傷。前期研究[1-2]及文獻[3-4]報道，在心肌細胞缺氧復(fù)氧（hypoxia/reoxygenation,H/R）狀態(tài)下，鈣拮抗劑除了阻斷L-型鈣通道外，存在非L-型鈣通道依賴地保護心肌細胞的作用。
　　iPL

2、A2是磷脂酶A2家族的一亞族，能夠水解膜磷脂，生成花生四烯酸（AA）和溶血磷脂，已經(jīng)在心肌，平滑肌，腎小管上皮等組織中鑒定出來，其中，在心肌中有相對較高的活性，已有研究報道，iPLA2能夠在磷脂的重塑、凋亡、血管舒縮的調(diào)節(jié)、細胞的增殖、心肌缺血等方面發(fā)揮重要的作用[5~7]，肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣釋放可以激活iPLA2且激活后發(fā)揮催化作用時不需要鈣離子的參與。本論文為了研究鈣拮抗劑的非L-型鈣通道阻斷作用，在建立心肌細胞胞外無鈣H/R模型的基礎(chǔ)上，

3、觀察iPLA2是否參與H/R損傷，鈣拮抗劑通過iPLA2及相關(guān)信號通路抗損傷作用的機制。
　　方法：
　　1.通過Western blotting檢測H/R時iPLA2蛋白表達和SOD活性的時效關(guān)系，確定實驗H/R模型的時間點。
　　2.分別用激動劑LPS（或iPLA2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染）和拮抗劑BEL（或SiRNA干擾）使iPLA2在H/R時高表達和低表達，檢測氧自由基（SOD、MDA）、炎癥（AA）和早晚期凋亡的變化，得出i

4、PLA2的表達與無鈣H/R的“因果”關(guān)系。
　　3.在H/R的基礎(chǔ)上加上不同濃度的鈣拮抗劑（F2、Ver、Dil、Nif），用RT-PCR，Western blotting及酶活性試劑盒檢測iPLA2的表達，得出不同鈣拮抗劑對iPLA2表達的影響；同時檢測SOD、MDA、AA、MMP的變化，反映不同鈣拮抗劑抗心肌細胞H/R損傷的作用。
　　4.在H/R的基礎(chǔ)上用1×10-6M的鈣拮抗劑進行處理后，孵育iPLA2的激動劑脂多糖

5、（LPS），檢測iPLA2的活性，同時檢測SOD、MDA、AA的變化，來反映鈣拮抗劑抗心肌細胞H/R損傷是否通過iPLA2實現(xiàn)。
　　5. Western blotting檢測 iPLA2、PKA、c-fos、PKC、p-ERK、p-JNK、p53的表達，Elisa檢測 cAMP的表達。探討鈣拮抗劑抗 H/R損傷是否通過H/R---PKC---iPLA2---ERK---JNK---p53或者 H/R---iPLA2---cAMP

6、---PKA---c-fos信號通路實現(xiàn)。
　　結(jié)果：
　　1.與0Ca組比， H30min/R30min和H45min/R30min時， iPLA2蛋白顯著高表達（P<0.05）；缺氧45min后，SOD活性持續(xù)降低（P<0.05）。
　　2.與H/R組比，轉(zhuǎn)染iPLA2的質(zhì)粒或孵育激動劑LPS后，iPLA2的蛋白和活性進一步升高(P<0.01)，SOD活性進一步下降，MDA和AA分泌也進一步增加，晚期凋亡顯明加重（

7、P<0.01）；用SiRNA或抑制劑BEL干擾iPLA2的表達后，iPLA2的mRNA和活性則進一步下降（P<0.05），SOD活性顯著恢復(fù)，MDA和AA分泌亦顯著減少，早晚期凋亡都得到抑制（P<0.01）。
　　3.與0Ca組比，H/R組iPLA2mRNA、蛋白、活性表達增加，SOD顯著性下降，MDA和AA分泌顯著增加，線粒體膜電位下降，早期凋亡加重（P<0.05），分別加上不同濃度的F2、Ver、Nif處理后，量效依賴地降低了

8、iPLA2的表達（P<0.05）；同時，顯著升高了SOD的活性，降低了MDA、AA的分泌，減輕了早起凋亡的發(fā)生（P<0.05）。而Dil對上述指標(biāo)無影響（P>0.05）。
　　4.與H/R組比，分別加上1×10-6M的F2、Ver、Nif，iPLA2的表達降低，孵育激動劑LPS后，F(xiàn)2、Ver、Nif的作用不同程度地被抑制，顯著地增加了iPLA2的表達，降低了SOD活性，增加了MDA和AA的分泌。（P<0.05）
　　5.與

9、H/R組比，F(xiàn)2顯著的降低了iPLA2、p-ERK、PKA、c-fos的表達，增加了cAMP的表達（P<0.05），對PKCδ、p-JNK的表達無影響（P>0.05）；Ver、Nif對cAMP、PKA， c-fos，PKCδ，p-ERK，p-JNK無影響（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1. iPLA2參與了心肌細胞無鈣H/R損傷，高表達和活性升高可加重損傷，低表達和活性降低可減輕損傷。
　　2.無鈣H/R可引起iP