Xc轉(zhuǎn)運(yùn)體和金屬蛋白酶參與小腦顆粒神經(jīng)元同型半胱氨酸引起ERK-,1-2-的磷酸化.pdf

1、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1和2(ERK1/2)在蘇氨酸/絲氨酸殘基上發(fā)生磷酸化形成活化形式的ERK1/2(p-ERK1/2)。該磷酸化及其下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在神經(jīng)元發(fā)育過程中具有重要意義。在成熟腦內(nèi),ERK1/2的磷酸化與記憶形成和突觸可塑性密切相關(guān)。
　　 高同型半胱氨酸血癥與血管疾病,認(rèn)知功能障礙,神經(jīng)系統(tǒng)病變等有關(guān),目前正在引起人們越來越多的關(guān)注。正常人同型半胱氨酸血漿濃度為10 μM以下,隨著年齡的增長有輕度升高的現(xiàn)象,同型半

2、胱氨酸是必需氨基酸蛋氨酸的代謝產(chǎn)物,又可在蛋氨酸合成酶的作用下,重新甲基化為蛋氨酸,此過程需葉酸或維生素B12的參與。
　　 在體內(nèi)外試驗(yàn)中,暴露在不同濃度的同型半胱氨酸可引起細(xì)胞死亡。而同型半胱氨酸的毒性機(jī)制可能是刺激NMDA型谷氨酸受體和親代謝型谷氨酸受體引起。另外,Robert發(fā)現(xiàn)在海馬切片,100 μM同型半胱氨酸引起的ERK1/2磷酸化可被NMDA、非NMDA和代謝型谷氨酸受體拮抗劑所抑制,表明谷氨酸釋放參與此過程。<

3、br>　　 本試驗(yàn)中,微摩爾濃度的同型半胱氨酸在原代培養(yǎng)的小腦顆粒神經(jīng)元通過上皮生長因子受體(EGFR)間接激活途徑引起ER-K1/2磷酸化。在EGFR間接激活中,Gq或Gi/o蛋白耦聯(lián)受體激活或細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度升高,均可導(dǎo)致金屬蛋白酶催化的EGFR配體釋放,EGFR在腦內(nèi)廣泛存在。但在無必需氨基酸的鹽溶液中孵育時,只有毫摩爾量的同型半胱氨酸才能引起ERK1/2磷酸化,且該磷酸化過程不依賴于間接激活。微摩爾量的同型半胱氨酸引起ER

4、K1/2磷酸化需要谷氨酸前體谷氨酰胺存在。這些研究表明,微摩爾濃度同型半胱氨酸產(chǎn)生效應(yīng)過程中可能存在Xc-轉(zhuǎn)運(yùn)體參與。同型半胱氨酸通過Xc-轉(zhuǎn)運(yùn)體與胱氨酸/谷氨酸交換,引起局部同型半胱氨酸濃度增高。
　　 谷氨酸/胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體又稱為Xc-系統(tǒng),在Xc-系統(tǒng)作用下,細(xì)胞釋放1分子的谷氨酸,并攝取1分子胱氨酸入胞,兩者形成耦聯(lián)轉(zhuǎn)運(yùn)。胱氨酸在胞內(nèi)迅速被還原成半胱氨酸,一部分參與胞內(nèi)重要自由基清除劑谷胱甘肽的合成,另一部分則出胞氧化成胱

5、氨酸,重新參與Xc-系統(tǒng)循環(huán)。
　　 金屬蛋白酶對調(diào)節(jié)細(xì)胞微環(huán)境起重要作用,通過參與細(xì)胞外基質(zhì)降解而影響細(xì)胞遷移、分化、增殖和存活。目前關(guān)于金屬蛋白酶在腦內(nèi)的表達(dá)是研究的熱點(diǎn)。本課題組曾報道,在星形膠質(zhì)細(xì)胞,金屬蛋白酶參與EGFR間接激活途徑,而與EGFR間接激活有關(guān)的金屬蛋白酶為基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP),含去整合素域和金屬蛋白酶域的蛋白酶(ADAM)。本篇文章主要研究Xc-轉(zhuǎn)運(yùn)體和金屬蛋白酶在小腦顆粒神經(jīng)元同型半胱氨酸引起ER

6、K1/2磷酸化中的作用。即：(1)闡明同型半胱氨酸引起小腦顆粒神經(jīng)元上皮生長因子受體間接激活的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。(2)研究System Xc-系統(tǒng)是否參與同型半胱氨酸引起小腦顆粒神經(jīng)元ERK1/2磷酸化的過程。(3)神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞上存在的MMP和ADAM類型。(4)參與神經(jīng)細(xì)胞上皮生長因子受體間接激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的金屬蛋白酶類型。
　　 方法:
　　 采用原代培養(yǎng)的小腦顆粒神經(jīng)元。將細(xì)胞在37℃無血清相關(guān)培養(yǎng)液中孵育2

7、0分鐘,含有不同濃度的同型半胱氨酸以及相關(guān)特異性抑制劑。應(yīng)用冰PBS洗滌細(xì)胞,加入裂解液,終止反應(yīng),收集細(xì)胞。進(jìn)行凝膠電泳,免疫印跡分析。使用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,多組資料用one-way ANOVA方法進(jìn)行比較,P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、同型半胱氨酸誘導(dǎo)的ERK1/2磷酸化呈時間和濃度依賴性。
　　 將細(xì)胞在培養(yǎng)液(含必需氨基酸、2 mM谷氨酰胺、200 μM胱

8、氨酸)中孵育20分鐘。在同型半胱氨酸濃度為100 μM及大于100 μM時,磷酸化水平開始升高。曲線表明同型半胱氨酸引起ERK1/2磷酸化是濃度依賴性的,而球100 μM和1 mM同型半胱氨酸作用在細(xì)胞10分鐘后,p-ERK1/2開始升高,兩者均是在20分鐘時升高最為顯著且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,在40分鐘時下降。
　　 2、EGFR(酪氨酸激酶受體)和鋅依賴的金屬蛋白酶參與同型半胱氨酸引起的ERK1/2磷酸化。
　　 AG14

9、78為上皮生長因子受體特異性抑制劑,GM6001為金屬蛋白酶抑制劑。二者均可抑制同型半胱氨酸20分鐘時引起的ERK1/2磷酸化增加,說明此過程為EGFR間接激活途徑,并NEGFR間接激活是依賴于金屬蛋白酶裂解EGF受體的配體脫落進(jìn)而激活EGFR。
　　 3、NMDA和非NMDA受體參與同型半胱氨酸誘導(dǎo)的ERK1/2磷酸化。
　　 MK801為NMDA受體拮抗劑,CNQX為非NMDA受體拈抗劑,二者均可完全阻斷100 μM

10、同型半胱氨酸誘導(dǎo)的ERK1/2磷酸化,而對1 mM同型半胱氨酸引起的ERK1/2磷酸化抑制程度不完全,提示1 mM同型半胱氨酸引起ERK1/2磷酸化過程中可能存在其他信號傳導(dǎo)途徑。
　　 4、在不含必需氨基酸的PBS中,代謝型谷氨酸受體參與毫摩爾濃度同型半胱氨酸引起的ERK1/2磷酸化。
　　 上述實(shí)驗(yàn)均在含必需氨基酸、2 mM谷氨酰胺和200μM胱氨酸條件下得到。但在不含必需氨基酸的PBS中,1 mM同型胱氨酸并不引起

11、ERK1/2磷酸化,2 mM同型半胱氨酸開始引起ERK1/2磷酸化,并且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,在10 mM-15 mM時達(dá)到最大。AG1478、GM6001、MK801和CNQX均不能抑制ERK1/2的磷酸化,但是,10 mMN型半胱氨酸誘導(dǎo)的ERK1/2磷酸化可以被mGluR1抑制劑LY367385和mGluR5抑制劑MPEP所抑制。
　　 5、同型半胱氨酸誘導(dǎo)的ERK1/2磷酸化可被DIDS和SPAP抑制。
　　 我們用Xc

12、-轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑100 μM DIDS、300 μM SPAP來檢測Xc-轉(zhuǎn)運(yùn)體是否參與同型半胱氨酸引起的ERK1/2磷酸化。結(jié)果兩種抑制劑均可阻斷ERK1/2磷酸化,表明ERK磷酸化依賴于Xc-轉(zhuǎn)運(yùn)體。
　　 6、MMP和ADAM在小腦顆粒神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞上的表達(dá)。
　　 我們用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測MMP和ADAM在小腦顆粒神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá),發(fā)現(xiàn)存在15種表達(dá)。其中,與腦組織相比,在星形膠質(zhì)細(xì)胞,MMP1

13、5、MMP24、MMP25表達(dá)減少,而MMP9在神經(jīng)元表達(dá)減少。
　　 討論：
　　 1、微摩爾和毫摩爾濃度同型半胱氨酸作用的比較
　　 NMDA和非NMDA受體拮抗劑均可完全阻斷100 μM同型半胱氨酸引起的ERK1/2磷酸化,表明NMDA和非NMDA受體相繼激活,上述反應(yīng)要求介質(zhì)中谷氨酰胺存在。而當(dāng)無谷氨酰胺存在時需要十倍濃度的同型半胱氨酸才能引起反應(yīng)。在此條件下,ERK1/2磷酸化不依賴于間接激活,離子型谷

14、氨酸受體拈抗劑不能抑制ERK1/2磷酸化,但是代謝型谷氨酸受體mGluR1和mGluR5抑制劑確能阻斷此反應(yīng)。
　　 2、谷氨酰胺和Xc-轉(zhuǎn)運(yùn)體的作用
　　 微摩爾濃度同型半胱氨酸誘導(dǎo)ERK1/2磷酸化需要谷氨酸前體谷氨酰胺的存在,表明Xc-轉(zhuǎn)運(yùn)體可能參與此過程,用Xc-轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑DIDS和SPAP可抑制反應(yīng)證實(shí)了這一點(diǎn)。Xc-轉(zhuǎn)運(yùn)體在生理上是細(xì)胞內(nèi)的谷氨酸和細(xì)胞外的胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體。使君子氨酸既是Xc-轉(zhuǎn)運(yùn)體的底物,又是

15、非NMDA受體激動劑。而且,使君子氨酸可以“自我敏感化”。因?yàn)橥桶腚装彼峒仁枪劝彼崾荏w激動劑而且可與Xc-轉(zhuǎn)運(yùn)體作用,因此我們猜測同型半胱氨酸也有類似的“自我致敏”作用,而且上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果也與此相符。
　　 在小腦顆粒神經(jīng)元內(nèi)谷氨酰胺酶作用下,谷氨酰胺可代謝為谷氨酸,細(xì)胞外液中含有一定濃度的谷氨酰胺時可以激活Xc-轉(zhuǎn)運(yùn)體,使細(xì)胞外谷氨酸與細(xì)胞內(nèi)累積得同型半胱氨酸交換。
　　 3、同型半胱氨酸的神經(jīng)毒性作用
　　

16、體內(nèi)同型半胱氨酸的神經(jīng)毒性作用很可能是因?yàn)槲⒛枬舛鹊耐桶腚装彼峒せ铍x子型受體所致。目前研究揭示胱氨酸/谷氨酸交換體介導(dǎo)的“自我致敏”作用在臨床相關(guān)濃度同型半胱氨酸的神經(jīng)毒性中起重要作用。提示我們轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑可能對高同型半胱氨酸血癥有神經(jīng)保護(hù)作用。Ferrer等人研究證明ERK1/2磷酸化可對抗興奮性中毒而起神經(jīng)保護(hù)作用。
　　 4、金屬蛋白酶在星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的表達(dá)及其在EGFR間接激活中的作用
　　 有人利用核

17、糖核酸酶保護(hù)測定發(fā)現(xiàn)在成年小鼠腦內(nèi)存在低水平的MMP2、MMP9、MMP1、MMP12、MMP14表達(dá),但我們卻發(fā)現(xiàn)MMP2和MMP9在小鼠腦內(nèi)表達(dá)水平比較高。ADAMs已被證明在多種動物腦內(nèi)存在,而IivariKarkkainen等人證實(shí)其在小鼠腦內(nèi)的存在。另外,我們發(fā)現(xiàn)在小鼠腦內(nèi)存在15種Mps表達(dá),并且與腦組織相比,在星形膠質(zhì)細(xì)胞,MMP15、MMP24、MMP25表達(dá)減少,而MMP9在神經(jīng)元表達(dá)減少。組織金屬蛋白酶抑制劑1(TI

18、MP-1)對MT-MMPs幾乎無抑制作用,而TIMP-2則可以抑制全部MMP。因此,我們可以應(yīng)用TIMP-1和TIMP-2來檢測MT-MMP是否參與蛋白酶裂解。許多研究表明,ADAM家族成員參與膜錨定蛋白外功能區(qū)脫落進(jìn)而引起生理功能的改變。但有趣的是,我們在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)ADAM17參與KC1引起星形膠質(zhì)細(xì)胞ERK1/2磷酸化,但KC1引起小腦顆粒神經(jīng)元ERK1/2磷酸化卻不需要ADAM17參與。
　　 結(jié)論：
　　 1、同