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文檔簡介
1、目的:脊柱骨折的患者常并發(fā)棘上韌帶、棘間韌帶損傷。但是韌帶損傷后不愈合或瘢痕愈合,常導致明顯的關(guān)節(jié)功能喪失和疼痛。而且盡管韌帶損傷后可以自愈,但愈合后韌帶的超微結(jié)構(gòu)及生化構(gòu)成發(fā)生了很大改變,即使在韌帶愈合后若干年內(nèi),其生物力學特性仍較正常韌帶差。近年來國內(nèi)外的學者嘗試采用生物學的方法來促進韌帶的愈合。其主要方法有細胞因子治療、基因治療和組織工程方法等。骨髓間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells,MSCs).作為干細胞
2、的一種,具有多方向分化的潛能。本實驗以MSCs為種子細胞,用組織工程的方法來促進韌帶的愈合。觀察該方法促進大鼠棘上、棘間韌帶損傷愈合的效果。 方法:1.MSCs的體外培養(yǎng)。利用密度梯度離心法分離獲取大鼠股骨MSCs。以2.0×105/mL的密度接種于DMEM培養(yǎng)液中。原代細胞增殖達到鋪滿瓶底約80%時,按1:3比例進行傳代。2.細胞—膠原海綿復合體的制備。在第三代細胞的培養(yǎng)液中加入3mg/L BrdU培養(yǎng)24小時予以標記。然后用
3、胰蛋白酶消化,并制成細胞懸液,用DMEM培養(yǎng)液稀釋成10×106/mL的濃度,將其滴到已用紫外線消毒的膠原海綿上,5% CO2孵育箱中37℃恒溫培養(yǎng)24小時,使細胞吸附于膠原海綿上制成細胞——膠原海綿復合體。3.動物模型的建立。切斷大鼠LA—L5間的棘上、棘間韌帶。實驗組將細胞—膠原海綿復合體移植于損傷處,對照組僅移植以膠原海綿。4.HE染色。于移植后第4周處死動物,切取標本,作組織學檢查。每個標本選取一張切片進行HE染色。5.免疫組化
4、染色。再次選取每個標本的切片,做免疫組化染色。胞核棕黃色者為陽性染色細胞。 結(jié)果:1.MSCs的體外培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察可見,MSCs接種3天后即有部分細胞貼壁。培養(yǎng)12—14天細胞生長成單層。傳代后,MSCs增殖明顯加快9—10天既可融合成單層。2.動物模型結(jié)果:20只動物均存活良好。3.組織學觀察結(jié)果:實驗組術(shù)后4周可見6例移植處形成韌帶樣組織,可見形態(tài)一致、排列方向與正常組織接近的成纖維細胞,類似正常韌帶組織。對照組所形
5、成的新生組織含較多脂肪組織且細胞排列紊亂,膠原纖維呈松散網(wǎng)絲狀。兩組間愈合較優(yōu)者所占比率的差異具有顯著性(P<0.05)。4.免疫組化結(jié)果:于實驗組切片可見胞核為棕褐色的陽性細胞。對照組未見陽性染色細胞。 討論:MSCs為較為理想的種子細胞。使用Ⅰ型膠原作為載體也較為合理。修復損傷韌帶的部分組織來源于移植的MSCs。MSCs在不添加外源性生長因子的情況下,可在體內(nèi)對韌帶缺損進行有效修復。實驗組韌帶恢復較好,對照組恢復的相對較差。
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