VEGF基因在漢族先天性房室間隔缺損患者中的突變分析.pdf

1、背景：先天性房室間隔缺損（Atrioventricular septal defect, AVSD）是先天性心臟病的一種，又稱為心內(nèi)膜墊缺損，是由于存在房室間隔（房間隔下部、室間隔上部）以及中央心內(nèi)膜墊組織的缺損而造成左右心腔之間的異常交通。根據(jù)其缺損的類型可分為部分性、過渡性及完全性三種類型，其中以完全性AVSD 的病情最嚴(yán)重。AVSD 病人往往早期即出現(xiàn)明顯的心力衰竭和肺動(dòng)脈高壓；而且由于房室瓣膜（二尖瓣、三尖瓣或房室共同瓣）失去心

2、內(nèi)膜墊組織的支撐，外科手術(shù)治療效果很差；其他類型AVSD 也依缺損的類型、大小及合并其他畸形等情況而嚴(yán)重程度不同。AVSD 患者既存在于散發(fā)人群中，也有家族性病例報(bào)道；很多病例還合并有一些綜合征，最常見的是唐氏綜合征（Down Syndrome），大約2/3 的唐氏綜合癥患者合并有先天性心臟病，其中將近一半是AVSD，表現(xiàn)出明顯的密集發(fā)病現(xiàn)象，其原因目前不明；而先心病同時(shí)也是唐氏綜合征患者最主要的死亡原因之一。AVSD 的發(fā)生機(jī)制尚未明

3、了。心臟的房間隔下部、室間隔上部以及二尖瓣、三尖瓣等組織均由胚胎早期的房室心內(nèi)膜墊（AV EndocardialCushion）發(fā)育而成，任何可以影響心內(nèi)膜墊發(fā)育環(huán)節(jié)的因素，都有可能導(dǎo)致AVSD 的形成。先前的研究表明血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelial growh factor，VEGF) 信號(hào)通路在胚胎心內(nèi)膜墊的形成過程中發(fā)揮重要作用。因此我們推測(cè)位于染色體6p12 上VEGF 基因很有可能是AVSD 的侯選基因

4、。然而到目前為止，國(guó)內(nèi)外仍然沒有明確VEGF 基因是否與AVSD 的發(fā)生有關(guān)聯(lián)。因此本研究通過對(duì)123例不同類型的AVSD 患者VEGF 的8 個(gè)編碼外顯子及其側(cè)翼測(cè)序進(jìn)行研究分析，以調(diào)查AVSD 患兒中VEGF 基因的突變情況，旨在揭示VEGF 基因在先天性房室間隔缺損發(fā)生中的作用，并試圖找出帶有VEGF 基因突變患者的基因型與表型的關(guān)系，為預(yù)防AVSD 的發(fā)生及制訂防治對(duì)策提供一定的科學(xué)依據(jù)。
　　 目的：①調(diào)查AVSD患兒

5、中VEGF基因的突變情況。②分析VEGF基因突變患者的基因型與表型的關(guān)系。
　　 方法：⑴收集2007 年1 月-2010 年12 月在上海市兒童醫(yī)院及上海兒童醫(yī)學(xué)中心住院治療的先天性房室間隔缺損患兒123 例。所入選的AVSD病人均經(jīng)過超聲心動(dòng)圖，心導(dǎo)管造影術(shù)或者外科手術(shù)證實(shí)。7 例合并有21-三體綜合癥患兒均經(jīng)過常規(guī)染色體檢查確診。健康對(duì)照組為同期在上海市兒童醫(yī)院兒童保健科體檢的正常兒童100 例，均由家長(zhǎng)簽署知情同意書。⑵

6、在取得每個(gè)病人和對(duì)照者家長(zhǎng)的同意并簽署同意書后，采集2mL外周血于肝素鈉抗凝管中?；蚪MDNA 的抽提全部采用DNA 試劑盒抽提并純化，-20℃保存，擴(kuò)增所有VEGF 基因8 個(gè)編碼外顯子及兩側(cè)各50 個(gè)堿基序列，通過DNA 序列測(cè)定了解有無基因突變，并分析基因變異是否導(dǎo)致氨基酸改變。⑶結(jié)果分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。以Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)確認(rèn)研究樣本的群體代表性。計(jì)數(shù)資料的比較采

7、用Fisher 精確概率法。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：①在123例患者中共發(fā)現(xiàn)19例位于外顯子1上的2種同義突變(17case c.C1025T aa S342S; 2 cases G225A aa E75E)，其中一種17例病例在NCBI的SNP數(shù)據(jù)庫中被提交為編碼SNP(rs25648)，4例(1 cases c. A825CaaV275V ; 1 case T708C aa E236E; 2 case

8、s A747G aa I249I)位于外顯子3上的3中同義突變，并且在100例對(duì)照組中未檢測(cè)到相同的突變。②1例患兒發(fā)現(xiàn)外顯子1上的插入突變（插入序列為22_23InsGACA）該患兒為男性，年齡為5個(gè)月，完全性房室間隔缺損合并21-三體綜合癥。通過對(duì)100例健康對(duì)照組樣本比較未發(fā)現(xiàn)相同位點(diǎn)的序列插入突變。這一突變導(dǎo)致開放閱讀框架在DNA編碼區(qū)第253-255位產(chǎn)生TAG終止密碼子，使得氨基酸產(chǎn)物從第8位即發(fā)生變化，肽鏈延長(zhǎng)至85位氨基

9、酸既出現(xiàn)TAG終止密碼子。這使得VEGF的肽鏈長(zhǎng)度由正常的412個(gè)氨基酸減少為84個(gè)氨基酸。③外顯子5上發(fā)現(xiàn)1例962位錯(cuò)義突變（堿基變化A>G，氨基酸變化為K321R）。該患兒為女性，年齡為7歲，部分性房室間隔缺損。通過對(duì)100例健康對(duì)照組樣本比較未發(fā)現(xiàn)相同位點(diǎn)的錯(cuò)義突變。④外顯子1的編碼前區(qū)15bp檢測(cè)到堿基錯(cuò)義突變A>C，此位置尚不處于VEGF的啟動(dòng)子區(qū)域。5.AVSD患者中VEGF基因的突變率為1.6％ (2/123)。

10、　　 結(jié)論：⑴VEGF 基因與人類的心內(nèi)膜墊和房室瓣的發(fā)育有關(guān)，VEGF 基因突變與先天性房室間隔缺損的發(fā)病具有相關(guān)性。⑵VEGF 在AVSD 患兒中基因突變的檢出率并不高，提示AVSD 可能是多基因遺傳，或者潛在的環(huán)境因素抑或是環(huán)境和基因的共同作用參與了AVSD 的形。⑶推測(cè)這些與AVSD 具有一定的相關(guān)性基因的作用機(jī)制可能于VEGF 有關(guān)聯(lián)，抑或是共同作用而影響心內(nèi)膜墊的缺損而導(dǎo)致AVSD的形成。本課題為深入探討VEGF 在AVS