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文檔簡介
1、目的:研制Daxx-C抗體,觀察Daxx在人乳頭瘤病毒16型(HPV16)陽性宮頸癌組織中的分布,分析Daxx與ATRX在Caski細胞中的定位和共定位,為進一步探討Daxx在HPV16所致宮頸癌進程中的作用及其機制奠定基礎(chǔ)。
方法:
(1)利用PRIMER5.0軟件,設(shè)計Daxx-C基因片段(626-740氨基酸殘基)引物,分別引入酶切位點BamHI與SalI,PCR擴增目的基因。將PCR產(chǎn)物連入載體pMD18-T
2、,構(gòu)建pMD18-T/DM626-740;然后,將BamHI和SalI酶切產(chǎn)物連入載體pET28a,經(jīng)酶切鑒定及DNA序列分析后,構(gòu)建原核表達載體pET28a/DM626-740。
(2)將質(zhì)粒pET28a/DM626-740轉(zhuǎn)化E.coli BL21,IPTG誘導(dǎo)表達,利用 Ni瓊脂糖凝膠層析柱純化表達產(chǎn)物,Western-blot檢測6His-DM626-740融合蛋白及其純化物。
(3)將6His-DM626-
3、740純化物以皮下多點注射和腹腔注射方式免疫接種4只8周齡雌性BALB/c小鼠;初次免疫3周后,再免疫1次;以后每1周加強免疫1次,共2次。每次免疫前及末次免疫后7天取血,ELISA測定抗體效價。飽和硫酸銨鹽析沉淀法初步純化抗血清,并用Western blot檢測之。
(4)收集正常宮頸上皮細胞、HPV16陽性不同級宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)和不同期宮頸癌病理標本,利用免疫組化技術(shù)檢測組織細胞中Daxx的分布與定位。
4、(5)培養(yǎng)Caski細胞,利用間接免疫熒光試驗和圖像軟件,觀察Daxx和ATRX在細胞中的分布與定位,分析兩者的共定位。
結(jié)果:
(1)雙酶切和DNA測序結(jié)果顯示,PCR正確擴增了Daxx-C基因片段 DM626-740,并成功連入載體pMD18-T或pET28a,構(gòu)建了質(zhì)粒pMD18-T/DM626-740與pET28a/DM626-740。
(2) pET28a/DM626-740在E.coli中誘導(dǎo)表
5、達分子量約19kDa目的蛋白6His-DM626-740,且該蛋白能被抗Daxx抗體檢出。
(3)融合蛋白6His-DM626-740純化物免疫小鼠后,制備的抗Daxx-C多克隆抗體效價為1:6400。(4)光學顯微鏡下,在正常宮頸上皮細胞,呈棕黃色的Daxx分布于細胞核;在CINⅠ, Daxx主要分布于核膜,核內(nèi)有少量分布;在CINⅡ、CINⅢ、原位癌和浸潤型宮頸癌中,Daxx密集分布于細胞漿和細胞膜。
(5)在C
6、aski細胞,顯綠色信號的Daxx主要分布于胞漿,少數(shù)分布于胞核且在核膜附近熒光較強,呈區(qū)域性聚集;顯紅色信號的ATRX主要分布于細胞核,少量表達于細胞漿;綠色信號與紅色信號融合后出現(xiàn)黃色信號。
結(jié)論:
?。?)構(gòu)建的原核表達載體pET28a/DM626-740能在E.coli中表達目的蛋白6His-DM626-740。(2)研制的Daxx-C抗體可用于檢測組織細胞中的Daxx。在HPV16所致宮頸癌進程中,Daxx從
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