降鈣素基因相關(guān)肽5247單核苷酸多態(tài)性(A-C)對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞生物學(xué)特性的影響.pdf

1、牙周炎是侵犯牙齦和牙周支持組織的慢性炎癥性的破壞性疾病，它是引起牙齒缺失的主要原因之一。以前認(rèn)為牙周炎的發(fā)病與進(jìn)展主要受細(xì)菌及其他環(huán)境因素的影響與調(diào)節(jié)。最近，有充足的證據(jù)表明基因在該病的發(fā)病和進(jìn)展中起著重要的作用。
　　 我們的前期研究發(fā)現(xiàn)：降鈣素基因相關(guān)肽(calcitoningene-relatedpeptide，CGRP)陽性神經(jīng)纖維廣泛存在于牙周組織中，尤其是牙周炎的起始部位；牙周炎時(shí)，牙周組織中的CGRP陽性神經(jīng)纖維顯

2、著增多，并向周圍間質(zhì)釋放；一定濃度的CGRP可促進(jìn)體外培養(yǎng)的牙周膜成纖維細(xì)胞的增殖。
　　 另外國(guó)外有研究報(bào)道CGRP基因存在四個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，并且發(fā)現(xiàn)與帕金森氏病和精神病的發(fā)病有關(guān)。在以前一系列的研究中發(fā)現(xiàn)：CGRP+5247位點(diǎn)存在等位基因雜合子多態(tài)性現(xiàn)象；CGRP+5247位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與廣東人成人重度牙周炎有相關(guān)性。雖然目前對(duì)CGRP與牙周炎發(fā)生關(guān)系的研究很多，但是研究CGRP基因多態(tài)性對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞生物學(xué)特性的

3、影響仍需實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
　　 本研究通過構(gòu)建CGRP基因多態(tài)性重組腺病毒，轉(zhuǎn)染人牙周膜成纖維細(xì)胞，進(jìn)一步檢測(cè)了CGRP多態(tài)性基因?qū)θ搜乐苣こ衫w維細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，為進(jìn)一步研究CGRP基因與牙周炎的關(guān)系提供了細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。
　　 第一部分：人牙周膜成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)及檢測(cè)
　　 目的：取材培養(yǎng)人牙周膜成纖維細(xì)胞并檢測(cè)其組織胚胎學(xué)來源
　　 方法：離體牙取自長(zhǎng)海醫(yī)院門診口腔科因正畸而拔出的雙尖牙，年齡12-2

4、6歲，所選牙齒無齲壞、根尖周疾病及牙周炎。采用酶消化+組織貼附的方法進(jìn)行人牙周膜成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)，在原代細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到一定數(shù)量后，局部消化傳代培養(yǎng)。對(duì)第4代細(xì)胞進(jìn)行人牙周膜成纖維細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察和免疫組織化學(xué)鑒定(采用sABC法，進(jìn)行波形絲蛋白和細(xì)胞角蛋白染色)。
　　 結(jié)果：原代培養(yǎng)出人牙周膜成纖維細(xì)胞，免疫熒光鑒定波形絲蛋白染色顯示陽性，細(xì)胞角蛋白染色顯示陰性。
　　 結(jié)論：成功原代培養(yǎng)出中胚層來源的人牙周膜成纖維細(xì)

5、胞。
　　 第二部分：構(gòu)建降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)5247單核苷酸多態(tài)性(A/C)的重組腺病毒，轉(zhuǎn)染人牙周膜成纖維細(xì)胞并測(cè)定細(xì)胞內(nèi)CGRP基因及表達(dá)蛋白的變化
　　 目的：制備與鑒定攜帶CGRP-A和CGRP-C的重組腺病毒并將CGRP-A，CGRP-C基因轉(zhuǎn)染入人牙周膜成纖維細(xì)胞
　　 方法：以計(jì)算機(jī)軟件輔助設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增CGRP-A開放閱讀框序列，通過重疊PCR點(diǎn)突變活動(dòng)CGRP-C開放閱讀框序列；分別將C

6、GRP-A和CGRP-C插入pShuttle中構(gòu)建腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle-CGRP-A及pShuttle-CGRP-C，經(jīng)酶切線性化后采用電穿孔法將其與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1一起轉(zhuǎn)化到BJ5183大腸桿菌電感受態(tài)細(xì)菌中，挑選同源重組質(zhì)粒，酶切線性化后利用脂質(zhì)體法將其轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞包裝成重組腺病毒顆粒，觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)現(xiàn)象，收集細(xì)胞反復(fù)凍融、裂解，獲得高滴度重組腺病毒，通過酶切分析及PCR分析，鑒定重組腺

7、病毒是否含有插入的目的序列。Ad-CGRP-A，Ad-CGRP-C重組腺病毒以及對(duì)照組Ad-EGFP分別轉(zhuǎn)染處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人牙周膜成纖維細(xì)胞中，72小時(shí)后抽RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用定量PCR和Westen-blot等方法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)CGRP基因及表達(dá)蛋白的變化。
　　 結(jié)果：DNA序列測(cè)定結(jié)果證實(shí)重組質(zhì)粒載體pShuttle-CGRP-A及pShuttle-CGRP-C構(gòu)建正確，插入序列位置正確。PCR及酶切鑒定結(jié)果，重組腺

8、病毒含有目的插入序列。定量PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了CGRP-A，CGRP-C基因的人牙周膜成纖維細(xì)胞組，CGRP基因含量明顯高于對(duì)照組。測(cè)序顯示兩實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)確實(shí)含有CGRP-A與CGRP-C基因序列。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建Ad-CGRP-A，Ad-CGRP-C重組腺病毒載體，并成功將CGRP-A，CGRP-C基因轉(zhuǎn)染入人牙周膜成纖維細(xì)胞中。
　　 第三部分：檢測(cè)轉(zhuǎn)染了CGRP-A，CGRP-C基因的人牙周膜成纖維細(xì)胞的膠原

9、mRNA與膠原蛋白的表達(dá)，細(xì)胞增殖能力以及細(xì)胞成骨分化
　　 目的：研究CGRP-A，CGRP-C基因多態(tài)性對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。
　　 方法：實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞抽提RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA后，用定量PCR和Westen-blot測(cè)定細(xì)胞內(nèi)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型膠原蛋白mRNA含量和膠原蛋白表達(dá)；用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期，觀察兩基因?qū)?xì)胞增殖的影響；鈣鹽染色定性觀察細(xì)胞成骨分化。
　　 結(jié)果：顯示，含有C

10、GRP-A基因的細(xì)胞，Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原蛋白mRNA含量及膠原蛋白的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，含有CGRP-C基因的細(xì)胞Ⅲ、Ⅳ型膠原蛋白mRNA含量則表達(dá)上明顯低于對(duì)照組；細(xì)胞周期測(cè)定結(jié)果顯示，含有CGRP-C基因的細(xì)胞增殖能力明顯弱于對(duì)照組和CGRP-A實(shí)驗(yàn)組；鈣鹽染色可于含有CGRP-A基因的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)棕黑色條帶，但變化不明顯。
　　 結(jié)論：可以認(rèn)為多態(tài)性的CGRP-C基因抑制膠原蛋白分泌，可能在牙周炎發(fā)病當(dāng)中抑制膠原合成，引起牙周