CREB-1載體的構建及其對HSC中內(nèi)源性TGF-β3分泌的影響.pdf

1、第1部分構建及驗證CREB-1干擾與表達質粒載體
　　目的:分別構建及獲取有效的CREB-1干擾與過表達質粒載體,為實驗提供相關的干預材料及基礎。
　　方法:利用堿基互補配對原理,通過生物信息學軟件及CREB-1基因mRNA序列,設計3條理論上能靶向抑制CREB-1表達的莖環(huán)狀shRNA,分別命名為sh-CREB1-1、sh-CREB1-2與sh-CREB1-3。以pGenesil-1.1為載體,含增強綠色熒光蛋白(EGFP

2、),通過基因工程技術合成含有上述shRNA的質粒,另合成針對內(nèi)參GADPH的sh-GADPH與不針對任何基因的空白質粒sh-BLANK。CREB-1表達載體pRSV-CREB-1由Michael E.Greenberg教授贈與,常規(guī)從紙片中提取及擴增,并行DNA測序以初步驗證其序列。將以上6組質粒分別用脂質體法轉染至HSC-T6,轉染后12h、24h、36h、48h、60h、72h在熒光顯微鏡下觀察GFP初步判斷轉染效果及效率,然后分別

3、提取細胞總蛋白,Western Blot檢測CREB-1及內(nèi)參GAPDH蛋白的表達變化。
　　結果:pRSV-CREB-1表達載體經(jīng)DNA測序后與GenBank中CREB-1堿基序列相比對,其編碼CREB-1蛋白氨基酸的堿基一致率達93.4％,并且CREB-1磷酸化關鍵位點(S133)的氨基酸區(qū)域完全一致。含有EGFP的質粒組細胞從轉染后24小時到72小時均能觀察到綠色熒光,轉染后48h熒光最強,其轉染效率約為15％～20％。轉染

4、后48h,Western Blot結果顯示:與轉染sh-BLANK的空白組相比,sh-CREB1-1組、sh-CREB1-2組、sh-CREB1-3組、pRSV-CREB-1組HSC中CREB-1蛋白表達分別為0.61±0.17(P<0.05)、0.55±0.07(P<0.01)、0.94±0.27(P>0.05)、1.60±0.11(P<0.05);同時,與空白組相比,sh-GAPDH組的內(nèi)參GAPDH表達明顯下降0.20±0.08(

5、P<0.01)。
　　結論:成功構建及獲取CREB-1干擾及過表達質粒載體sh-CREB1與pRSV-CREB-1。3條干擾載體中sh-CREB1-2的抑制效果最佳,可作為后續(xù)實驗的首選干擾載體。sh-GAPDH組的結果進一步證實本轉染體系有效可行。
　　第2部分磷酸化CREB-1誘導HSC中內(nèi)源性TGF-β3的分泌
　　背景與目的:在大鼠腸上皮細胞中,存在CREB-1與TGF-β3反饋分泌環(huán),即兩者可相互促進對方的表

6、達。前期研究顯示外源性TGF-β3能夠誘導HSC中CREB-1蛋白的表達及促進該蛋白的磷酸化,而HSC中CREB-1是否也存在促進TGF-β3的通路目前尚不明確,本部分實驗為探討CREB-1及其磷酸化狀態(tài)對HSC中內(nèi)源性TGF-β3分泌的影響。
　　方法:利用上一部分工作所建立的轉染體系及篩選的CREB-1干擾載體sh-CREB1-2、表達質粒pRSV-CREB1及空白質粒轉染HSC,轉染后46小時換不含血清的培養(yǎng)基液并加(+)或

7、不加(-)入外源性TGF-β3處理,2小時后留取細胞外液及提取細胞胞漿和胞核蛋白,Western Blot法檢測HSC胞漿蛋白中CREB-1及胞核蛋白中磷酸化CREB-1(p-CREB-1)蛋白的表達,ELISA法檢測細胞外液中內(nèi)源性TGF-β3的分泌。另外,采用抑制CREB-1磷酸化試劑H89與促進CREB-1磷酸化試劑Forskolin(毛喉素)分別處理HSC細胞,檢測處理后細胞核蛋白中p-CREB-1表達及細胞外液中TGF-β3的

8、分泌。
　　結果:與空白轉染BLANK(-)組相比,sh-CREB1-2(-)組胞漿蛋白中的CREB-1及胞核蛋白中的p-CREB-1表達降低,分別為0.63±0.11(P<0.05)與0.93±0.10(P>0.05),細胞外TGF-β3分泌減少為0.81±0.18(P>0.05);pRSV-C(-)組中CREB-1及p-CREB-1蛋白表達上升為1.66±0.14(P<0.05)與1.23±0.14(P>0.05),細胞外TG

9、F-β3分泌為1.13±0.07(P>0.05)。與BLANK(+)組相比,sh-CREB1-2(+)組胞漿蛋白中的CREB-1及胞核蛋白中的p-CREB-1表達亦降低,分別為0.45±0.08(P<0.05)與0.32±0.08(P<0.05),細胞外TGF-β3分泌減少為0.35±0.05(P<0.05);pRSV-C(+)組胞漿蛋白中的CREB-1及胞核蛋白中的p-CREB-1表達升高,分別為2.19±0.08(P<0.05)與2

10、.75±0.14(P<0.05),細胞外TGF-β3分泌增多為2.56±0.19(P<0.05)。與空白對照(Control)組相比,H89組p-CREB-1蛋白表達降低為0.53±0.07(P<0.05),細胞外TGF-β3分泌減少為0.44±0.05(P<0.05);Forskolin組p-CREB-1蛋白表達升高為2.13±0.09(P<0.05),細胞外 TGF-β3分泌增多達3.76±0.11(P<0.05)。
　　結論