聚乙酰亞胺載體介導(dǎo)的高效基因傳遞方法.pdf

1、背景和目的：轉(zhuǎn)基因技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究和臨床治療領(lǐng)域。目前此技術(shù)包括使用病毒載體和非病毒載體兩類方法。病毒載體的優(yōu)點(diǎn)在于感染效率高，而缺點(diǎn)是具有免疫原性和致癌性，因此在臨床應(yīng)用上受到限制。非病毒載體主要包括脂質(zhì)體和陽(yáng)離子聚合物載體，脂質(zhì)體使用時(shí)間長(zhǎng)，發(fā)展成熟轉(zhuǎn)染效率高，但是其毒性較大，特別是在體內(nèi)應(yīng)用時(shí)更甚。陽(yáng)離子聚合物是一種新型非病毒載體，雖使用時(shí)間較短，但高效、低毒、低免疫原性和價(jià)廉的優(yōu)點(diǎn)使其倍受關(guān)注。而聚乙酰亞胺屬于陽(yáng)

2、離子聚合物，同樣具備此類載體的特征，因而已獲得廣泛的應(yīng)用，并且推廣至臨床的基因治療?？墒?，相對(duì)于經(jīng)典的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法，polyethylenimine（PEI）存在著轉(zhuǎn)染效率低、重復(fù)性差的明顯缺點(diǎn)，以致于PEI的應(yīng)用受限。于是，本研究在對(duì)影響PEI轉(zhuǎn)染的各項(xiàng)因素進(jìn)行優(yōu)化的基礎(chǔ)上，提出了一套操作方便、轉(zhuǎn)染效果好的改良程序，以實(shí)現(xiàn)以下目標(biāo)：（1）建立基于PEI轉(zhuǎn)染的高效制備亞病毒載體的方法；（2）通過(guò)平板離心技術(shù)提高PEI轉(zhuǎn)染細(xì)胞的效率和慢

3、病毒感染細(xì)胞的效率；（3）建立一套快速檢測(cè)細(xì)胞GFP表達(dá)水平從而檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率的方法。
　　方法：（1）對(duì)PEI轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的各項(xiàng)可能的影響因素進(jìn)行優(yōu)化處理，綜合提出一套高效制備慢病毒/逆轉(zhuǎn)錄病毒的方案；（2）利用平板離心技術(shù)研究合適的離心強(qiáng)度和轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞毒性的影響。在慢病毒感染細(xì)胞的過(guò)程中，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行平板離心的不同處理，研究離心時(shí)間和轉(zhuǎn)速對(duì)于細(xì)胞內(nèi)病毒載體的 RNA、DNA、蛋白水平的影響，調(diào)查離心對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染的可能作用。（3）

4、利用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)GFP，與常見檢測(cè)GFP的方法進(jìn)行對(duì)比，建立一套基于多功能酶標(biāo)儀的高效檢測(cè)GFP的方法。
　　結(jié)果：本課題研究（1）通過(guò)對(duì)PEI轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞影響因素的優(yōu)化，提出了一套優(yōu)化的轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞制備亞病毒載體的方法；（2）通過(guò)平板離心技術(shù)，大大提升了PEI轉(zhuǎn)染細(xì)胞和慢病毒感染細(xì)胞的效率，并發(fā)現(xiàn)離心增加轉(zhuǎn)染效率和感染效率都是通過(guò)改變轉(zhuǎn)染復(fù)合物或者病毒的空間分布所致；（3）基于多功能酶標(biāo)儀，建立了一套檢測(cè)GFP的方法