大鼠肝臟冷缺血再灌注損傷后共刺激分子B7-1，B7-2表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、【研究背景】 肝移植是當(dāng)今治療終末期肝病的唯一有效方法，然而目前在肝移植領(lǐng)域面臨著兩大難題，即供肝的缺血再灌注損傷和免疫排斥反應(yīng)。肝臟冷缺血再灌注損傷為肝臟移植的重要病理生理過(guò)程，它存在于肝臟的切取，保存，以及移植手術(shù)的各個(gè)環(huán)節(jié)。缺血再灌注損傷影響移植后肝臟的功能，與更為嚴(yán)重的原發(fā)性無(wú)功能有密切關(guān)系，并且增加了發(fā)生急性排斥反應(yīng)的幾率。此前雖然對(duì)Kupffer細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)于缺血再灌注損傷的肝組織已有許多相關(guān)報(bào)道，但關(guān)于共刺

2、激分子在冷缺血再灌注損傷肝組織的表達(dá)情況及其潛在作用仍尚未闡明。 T細(xì)胞活化與增殖依賴于雙信號(hào)：當(dāng)T細(xì)胞受體(TCR)與存在于抗原呈遞細(xì)胞(APC)表面的主要組織相容性復(fù)合肽復(fù)合物( MHC)相結(jié)合后，第一信號(hào)被激活；第二信號(hào)為共刺激信號(hào)，當(dāng)T細(xì)胞表面的共刺激分子受體與其配體相結(jié)合后，第二信號(hào)被激活，而B(niǎo)7-1(CD80)、B7-2(CD86)即是存在于抗原呈遞細(xì)胞表面的重要配體。當(dāng)T細(xì)胞僅有第一信號(hào)時(shí)，T將會(huì)處于一種特異性的無(wú)

3、能狀態(tài)。CD28是位于T細(xì)胞表面的一個(gè)共刺激分子B7的受體，通過(guò)它的介導(dǎo)，可刺激T細(xì)胞擴(kuò)增、促使細(xì)胞因子分泌，保持T細(xì)胞的反應(yīng)狀態(tài)。在體內(nèi)或體外運(yùn)用細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4融合蛋白(CTLA4-Ig)阻斷CD28與B7-1(CD80)和/或B7-2(CD86)結(jié)合[2,4-13]，將會(huì)抑制T細(xì)胞激活，從而在實(shí)驗(yàn)性的同種異體器官移植模型中抑制急性或慢性排斥反應(yīng)的發(fā)生。 從Takada和Chandraker A．等研究發(fā)現(xiàn)T淋巴細(xì)

4、胞共刺激通路參與了腎缺血再灌注損傷，眾多目光投向了共刺激分子在器官冷缺血再灌注損傷中的表達(dá)。而在肝移植手術(shù)中，供體肝臟在摘取、灌洗、保存、血流開(kāi)放等一系列環(huán)節(jié)中，供體肝臟都會(huì)受到冷缺血再灌注損的打擊。本實(shí)驗(yàn)將從免疫學(xué)角度來(lái)對(duì)大鼠肝臟冷缺血再灌注損傷進(jìn)行研究，應(yīng)用免疫組織化學(xué)和RT-PCR半定量技術(shù)分別檢測(cè)B7-1和B7-2蛋白及B7-1和B7-2mRNA的表達(dá)情況，從而進(jìn)一步探討冷缺血再灌注與肝臟移植急性排斥反應(yīng)的聯(lián)系，同時(shí)對(duì)抑制或減輕

5、與冷缺血再灌注有關(guān)的肝移植早期急性排斥反應(yīng)提出新的預(yù)防策略。就所查的文獻(xiàn)，國(guó)內(nèi)尚未檢索到關(guān)于冷缺血再灌注后共刺激分子表達(dá)與肝移植早期急性排斥反應(yīng)研究的論文或報(bào)道。 【目的】探討共刺激分子B7-1和B7-2在大鼠肝臟冷缺血再灌注損傷模型中的表達(dá)及其免疫學(xué)意義。 【方法】 1．健康雄性Wistar大鼠30只，體重200-250克，購(gòu)自山東大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)中心。將30只大鼠隨機(jī)分為3組：A組為假手術(shù)組(對(duì)照組)；B組為冷缺

6、血20min再灌注24h組；C組為冷缺血30min再灌注24h組。 2．動(dòng)物模型的建立參照胡建平[14]的方法：術(shù)前禁食12小時(shí)，不禁水，乙醚丌放吸入麻醉。B、C組分別用4℃乳酸林格氏液灌注，A組作正常對(duì)照。脾靜脈和右腎上腺靜脈分別作為灌注液流入和流出道，行在體原位低溫灌注，冷缺血時(shí)間分別為30min和60rain。B組和C組分別于再灌注24h取肝臟組織，A組于關(guān)腹后24h采集肝左葉組織標(biāo)本。 3．逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(R

7、T-PCR)半定量：采用Trizol(加拿大BBI公司產(chǎn)品)試劑盒提取組織標(biāo)本總RNA，以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)為內(nèi)參，β-actin、B7-1和B7-2的引物序列參照Naosuke Kojiima的文獻(xiàn)報(bào)道，由山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院協(xié)助合成。β-actin上游引物為：5’-ATGGARTCCTGTGGCATCCA-3’，下游引物為：5’-CGCTCAGGAGGAGCAATGAT-3,擴(kuò)增產(chǎn)物224bp；B7-1上游引物為：5’GGC

8、ATTGCTGTCCTGTGATTAC 3’，下游引物為：5’ACTCAGTTATGTTGGGGGTAGG 3’，擴(kuò)增產(chǎn)物314bp；B7-2上游引物為：5’GCTCGTAGTATTTTGGCAGGACC 3’，下游引物為：5’CGGGTATCCTTGCTTAGATGAGC 3’，擴(kuò)增產(chǎn)物337bp。兩步法RT-PCR反應(yīng)檢測(cè)B7-1、B7-2 mRNA表達(dá)。1％瓊脂糖凝膠電泳，Alpha Imager TM 2200凝膠成像系統(tǒng)觀察電

9、泳條帶存入圖像。以系統(tǒng)的SPOT DENSITY軟件分別測(cè)量?jī)?nèi)參照和B7-1、B7-2基因擴(kuò)增條帶的密度，以B7-1、B7-2條帶的密度與內(nèi)參照管家基因的密度比值代表基因表達(dá)的相對(duì)水平，作擴(kuò)增產(chǎn)物半定量分析。 4．免疫組化：應(yīng)用免疫組織化學(xué)SABC法，檢測(cè)30例肝臟組織中B7-1、B7-2蛋白表達(dá)情況，分析B7-1、B7-2蛋白表達(dá)與肝臟冷缺血再灌注損傷有關(guān)的排斥反應(yīng)的關(guān)系。 【結(jié)果】 1．B7.1 mRNA在B

10、，C組表達(dá)為0.529±0.089和0.618±0.074，均較A組(0.1314±0.012)明顯增高。B7-2mRNA在B組、C組表達(dá)為0.474±0.132和0.682±0.095，均較A組(0.163±0.054)明顯增高。 2．B7-1、B7-2 mRNA的表達(dá)水平在B組和C組之間具有顯著性差異，C組高于B組。 3．B7-1蛋白在B，C組表達(dá)為170.600±23.717和216.100±24.740，均較A組

11、(127.800±12.541)明顯增高；B7-2蛋白在B，C組表達(dá)為189.800±19.971和239.000±21.328，均較A組(131.700±22.969)明顯增高。 4．B7-1、B7-2蛋白表達(dá)水平在B組和C組之間具有顯著性差異，C組高于B組。 【結(jié)論】 1．冷缺血再灌注大鼠之肝臟，共刺激分子B7-1和B7-2 mRNA的表達(dá)明顯上調(diào)；冷缺血再灌注大鼠肝臟之免疫原性由于B7-1和B7-2mRNA