胚胎期雙酚A暴露對(duì)大鼠胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞分化的影響.pdf

1、目的：雙酚A(Bisphenol A,BPA)是一種廣泛存在于人類(lèi)生活環(huán)境中的內(nèi)分泌干擾物（Endocrine Disrupting Chemicals,EDCs）。流行病學(xué)證據(jù)表明，BPA暴露與2型糖尿病及肥胖的發(fā)生具有顯著的關(guān)聯(lián)性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，胚胎期BPA暴露可導(dǎo)致大鼠成年后出現(xiàn)肥胖、糖耐量受損及胰島素抵抗，但胚胎期BPA暴露的效應(yīng)到成年后顯現(xiàn)的原因尚不清楚，其相關(guān)的作用靶點(diǎn)也尚未闡明，為探索這一問(wèn)題，本研究以Wistar大鼠胚胎

2、期胰腺為研究對(duì)象，觀察胚胎期BPA暴露對(duì)于胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞分化的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。
　　方法：本實(shí)驗(yàn)采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和離體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)兩部分進(jìn)行研究。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：將孕鼠隨機(jī)分配至對(duì)照組、低劑量染毒組和高劑量染毒組，從胚胎期第0.5天，即E0.5（Embryonic day0.5）開(kāi)始分別給予玉米油、10μg/kg/day BPA和50μg/kg/day BPA灌胃染毒，直至胎鼠出生前一天，即E21.5。于胚胎發(fā)育中期（E15.5）

3、和胚胎發(fā)育末期（E21.5），收集胚胎胰腺進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。通過(guò)免疫組化染色，觀察E21.5胰腺內(nèi)分泌部α細(xì)胞和β細(xì)胞的分化結(jié)局以及多能祖細(xì)胞來(lái)源的Pdx1+細(xì)胞比例；通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR（Quantitative real-time Polymerase chain reaction，Q-PCR）檢測(cè)E15.5和E21.5胰腺中Insulin、Glucagon、Pdx1和Ngn3基因的表達(dá)水平，其中Insulin和Glucagon的表

4、達(dá)水平間接反映胰島素和胰高血糖素的基線分泌水平，Pdx1和Ngn3的表達(dá)水平分別為多能祖細(xì)胞和內(nèi)分泌祖細(xì)胞標(biāo)志性關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平。離體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)：本實(shí)驗(yàn)旨在排除母體內(nèi)分泌和代謝因素改變及機(jī)體反饋系統(tǒng)對(duì)胚胎胰腺生長(zhǎng)發(fā)育的影響，了解BPA的直接作用。于胚胎胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞分化起始時(shí)點(diǎn)E13.5，取未經(jīng)灌胃染毒的孕鼠胚胎，分離胰腺進(jìn)行離體培養(yǎng)，分為對(duì)照組、低劑量染毒組（0.5μg/LBPA）、中劑量染毒組（2.5μg/L BPA）和高劑量染

5、毒組（25μg/L BPA）。通過(guò)Q-PCR觀察胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞分化過(guò)程中Insulin、Glucagon、Pdx1和Nng3的動(dòng)態(tài)變化情況。
　　結(jié)果：母鼠孕期10μg/kg/day BPA暴露與離體培養(yǎng)過(guò)程中的0.5和2.5μg/L BPA暴露，對(duì)胚胎胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞的分化產(chǎn)生了影響，而50μg/kg/day的母體暴露與25μg/L的離體暴露則沒(méi)有效應(yīng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：在10μg/kg/day BPA暴露組中，胚胎發(fā)育末期胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞

6、的分化結(jié)局發(fā)生了變化，其中α細(xì)胞比例比對(duì)照組顯著增高，β細(xì)胞比例比對(duì)照組顯著降低，相應(yīng)的胰高血糖素和胰島素基因表達(dá)水平與對(duì)照組相比卻無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。胚胎發(fā)育中期，10μg/kg/day BPA暴露組的內(nèi)分泌祖細(xì)胞標(biāo)志物Ngn3的基因表達(dá)水平與對(duì)照組相比存在增高趨勢(shì)。在胚胎發(fā)育中期和末期，與β細(xì)胞內(nèi)分泌功能的維持密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子——Pdx1的基因表達(dá)水平不受BPA暴露影響。離體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)：在胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞分化過(guò)程中，離體培養(yǎng)第三天開(kāi)始，0.

7、5和2.5μg/L BPA暴露組與對(duì)照組相比，胰島素基因表達(dá)水平顯著降低，胰高血糖素基因表達(dá)水平顯著增高，內(nèi)分泌祖細(xì)胞標(biāo)志物Ngn3的基因表達(dá)水平顯著增高。多能祖細(xì)胞標(biāo)志物Pdx1基因表達(dá)水平同樣不受BPA暴露影響。
　　結(jié)論：胚胎胰腺發(fā)育期間，從內(nèi)分泌祖細(xì)胞向內(nèi)分泌細(xì)胞分化的過(guò)程中，母體10μg/kg/day BPA暴露與離體0.5和2.5μg/L BPA暴露，可引起內(nèi)分泌祖細(xì)胞關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Ngn3表達(dá)水平上調(diào)，從而促使內(nèi)分泌祖